{"product_id":"neb-c2528j","title":"نيو إنجلاند بيولابس، C2528J، ليمو21(DE3) بكتيريا الإشريكية القولونية المؤهلة","description":"\u003cb\u003eالفئات ذات الصلة\u003c\/b\u003e ذات الصلة: التعبير عن T7، سلالات التعبير عن البروتين في الإشريكية القولونية، الإشريكية القولونية، سلالات التعبير، \u003cb\u003eالتطبيقات\u003c\/b\u003e : التعبير عن T7، التعبير عن البروتين السام، التعبير عن البروتين الغشائي، \u003cb\u003eالمواصفات:\u003c\/b\u003e \u003cb\u003eمضاد حيوي لاختيار البلازميد،\u003c\/b\u003e المضادات الحيوية لاختيار البلازميد، تركيز العمل: أمبيسيلين 100 ميكروغرام\/مل، كاربينيسيلين 100 ميكروغرام\/مل، كاناميسين 30 ميكروغرام\/مل، ستربتوميسين 25 ميكروغرام\/مل، تتراسيكلين 15 ميكروغرام\/مل، \u003cb\u003eملاحظات الشحن:\u003c\/b\u003e يُشحن على ثلج جاف، \u003cb\u003eالأسئلة الشائعة\u003c\/b\u003e : س: ما هي المحاليل\/الوصفات (C2528)؟ ج: SOB: 2% ببتون نباتي (أو تريبتون)، 0.5% مستخلص خميرة، 10 ملي مولار كلوريد الصوديوم، 2.5 ملي مولار كلوريد البوتاسيوم، 10 ملي مولار كلوريد المغنيسيوم، 10 ملي مولار كبريتات المغنيسيوم، 0.17 مولار كلوريد الصوديوم. أجار LB: 1% تريبتون، 0.5% مستخلص خميرة، 1.5% أجار. س: ما هي خصائص السلالة (C2528)؟ ج: فيما يلي وصف لخصائص هذه السلالة التي تُسهم في فائدتها كسلالة للتعبير عن البروتين. تظهر الأنماط الجينية الكامنة وراء هذه الخصائص بين قوسين. بوليميراز الحمض النووي الريبي T7: (جين T7 1) مُشفّر بواسطة طليعة العاثية لامدا DE3 الموجودة داخل الكروموسوم. يُعبّر عن بوليميراز الحمض النووي الريبي T7 من مُحفّز lacUV5، وهو أقل حساسية لتثبيط الكاتابوليت من مُحفّز lac الأصلي. وبالتالي، قد تُظهر سلالات DE3 تعبيرًا غير مُحفّز عن البروتين المستهدف. يُعالج هذا الأمر بالتعبير عن الليزوزيم T7 (LysY). lysY: جين يُشفّر المتغير K128Y من الليزوزيم الخاص بفيروس T7. يفتقر LysY إلى نشاط الأميداز، ولكنه يحتفظ بقدرته على تثبيط بوليميراز الحمض النووي الريبي T7. نقص البروتياز ([lon] ompT): تعاني سلالات الإشريكية القولونية B من نقص طبيعي في بروتياز lon، الذي يعمل في سلالات K-12 على تحليل البروتينات المطوية بشكل خاطئ ومنع تراكم بعض البروتينات الخاصة بدورة الخلية. يتواجد بروتياز OmpT على سطح الإشريكية القولونية من النوع البري في كل من سلالات K-12 وB، ويُفترض أنه يُساعد الخلايا على استخلاص الأحماض الأمينية من بيئتها الخارجية. الخلايا التي تعاني من نقص في كلا البروتيازين أكثر استجابة لإنتاج البروتينات من الجينات المستنسخة. مقاومة العاثية T1 (fhuA2): تتطلب العاثية T1، وهي عاثية شديدة الضراوة، مستقبل امتصاص هيدروكسامات الحديديك في بكتيريا الإشريكية القولونية لكي تُصيب الخلايا. يؤدي حذف هذا الجين إلى مقاومة هذا النوع من العاثيات، ولكنه لا يؤثر بشكل ملحوظ على خصائص التحول أو النمو الخلوي. س: لماذا لا تتكون مستعمرات أو لا يوجد نمو في المزرعة السائلة (C2529)؟ ج: غالبًا ما تُعزى هذه النتيجة إلى التعبير القاعدي لمنتج الجين المستهدف، وهو ما يضر بحيوية الخلية. يكون التعبير القاعدي للبروتين المستهدف في سلالة NiCo21(DE3) مطابقًا للتعبير القاعدي في سلالة BL21(DE3). تسمح بعض أنظمة النواقل (وخاصةً تلك التي تستخدم مُحفز T7) بالتعبير دون الحاجة إلى مُحفز. إذا لزم تنظيم دقيق لتعبير T7، استخدم سلالة تُعبّر عن lysY: T7 Express lysY (NEB #C3010) تُنتج lysY طافرًا من الليزوزيم T7 الذي يرتبط ببوليميراز RNA T7، مما يُقلل من التعبير القاعدي للبروتين المستهدف. عند التحفيز، يُقلل بوليميراز RNA T7 المُصنّع حديثًا من الليزوزيم، مما يؤدي إلى التعبير عن البروتين المستهدف. T7 Express lysY\/Iq (NEB #C3013) تُعبّر عن lysY بالإضافة إلى الإفراط في التعبير عن lacI لكبح التعبير القاعدي لبوليميراز RNA T7. Lemo21(DE3) (NEB #C2528) BL21(DE3) تحتوي على نظام Lemo™. يتم تعديل تعبير LysY بواسطة L-رامنوز، مما يجعل تعبير بروتين T7 منظمًا بدقة وقابلًا للتعديل. س: لماذا يكون البروتين المُحفّز غير قابل للذوبان (C2528)؟ ج: تحقق من عدم الذوبان - هذا مهم لأن التعبير غير المنضبط لـ T7 غالبًا ما يؤدي إلى إنتاج كميات كبيرة جدًا من البروتين، مما قد يجعل البروتين المستهدف غير قابل للذوبان. الحلول المتاحة هي: التحفيز عند درجة حرارة منخفضة (20 إلى 30 درجة مئوية)، التحفيز في وقت مبكر من مرحلة النمو (OD600 = 0.3 أو 0.4)، اختبار التعبير باستخدام نطاق كامل من تركيزات L-رامنوز: من 0 إلى 2000 ميكرومولار (انظر الشكل في صفحة المنتج الرئيسية). س: لماذا لا يظهر أي بروتين على الهلام أو لا يوجد نشاط (C2528)؟ ج: تحقق من السمية - قد يعني عدم وجود بروتين أن الخلايا قد حذفت أو أزالت عناصر من بلازميد التعبير. قم بزراعة الخلايا لتحفيز إنتاج البروتين. قبل التحفيز مباشرة، ازرع عينة على طبقين متطابقين مع وبدون اختيار المضاد الحيوي. إذا كانت السمية مشكلة، فسيكون هناك فرق كبير بين عدد المستعمرات على الأطباق. سيقل عدد المستعمرات على الأطباق المحتوية على المضاد الحيوي (مما يشير إلى فقدان البلازميد) مقارنةً بالأطباق الخالية منه. تحقق من سلامة المستنسخ بتحليل إنزيمات التقييد و\/أو تسلسل الإطار المفتوح للقراءة (ORF). إذا كانت السمية هي المشكلة، فأضف 500 ميكرومول من L-رامنوز إلى أطباق الانتقاء وإلى وسط الاستنبات البادئ. س: هل يمكنني تخزين الخلايا المؤهلة عند -20 درجة مئوية بدلاً من -80 درجة مئوية؟ ج: يجب تخزين الخلايا المؤهلة عند -80 درجة مئوية. سيؤدي التخزين عند -20 درجة مئوية إلى انخفاض كبير في كفاءة التحويل (TE). عند اختبارها على بكتيريا الإشريكية القولونية المؤهلة NEB 5-alpha (NEB #C2987H)، فقدت الخلايا 94.5% من كفاءة التحويل بعد 24 ساعة فقط من التخزين عند -20 درجة مئوية. فقدت الخلايا 98.9% من كفاءة التحويل بعد يومين، و99.6% بعد أسبوع من التخزين عند -20 درجة مئوية. س: ما نوع أنابيب التحويل التي يجب استخدامها؟ ج: بالمقارنة مع أنبوب 2.0 مل المرفق مع خلايا NEB المؤهلة للاستخدام لمرة واحدة، فإن أنبوب إيبندورف 1.5 مل الذي اختبرناه كان مناسبًا تمامًا. س: ما حجم الحمض النووي الذي يمكن إضافته إلى الخلايا المؤهلة؟ ج: يؤثر حجم الحمض النووي المضاف إلى الخلايا المؤهلة على كفاءة التحويل. يُوصى باستخدام 1-5 ميكرولتر من الحمض النووي (بلازميد أو ناتج الربط) لكل 50 ميكرولتر من الخلايا المؤهلة. في 50 ميكرولتر من الخلايا المؤهلة، تنخفض كفاءة التحويل إلى 52% عند زيادة حجم الحمض النووي إلى 10 ميكرولتر (من 2 ميكرولتر). تنخفض كفاءة التحويل إلى 18% عند زيادة حجم الحمض النووي إلى 20 ميكرولتر (من 2 ميكرولتر). تنخفض كفاءة التحويل إلى 5.2% عند زيادة حجم الحمض النووي إلى 50 ميكرولتر (من 2 ميكرولتر). س: ما هي مدة صلاحية هذه السلالة (NEB #C2528H)؟ ج: تاريخ انتهاء الصلاحية هو سنة واحدة من تاريخ التحليل المرفق مع المنتج. س: هل خلايا NEB المؤهلة متوافقة مع بروتوكول \"Mix \u0026amp; Go\"؟ ج: يوجد بروتوكول \"Mix \u0026amp; Go\" يوفر طريقة سريعة لتحويل خلاياك ببساطة عن طريق إضافة البلازميد إلى الخلايا وزرعها. لا حاجة لخطوة الصدمة الحرارية. اختبرت NEB خلاياها المؤهلة في هذا البروتوكول مقابل منتج \"Mix \u0026amp; Go\" لشركة أخرى. لاحظنا أن كلا المنتجين ينتجان أعدادًا متقاربة من المستعمرات؛ ومع ذلك، فإن مستعمرات NEB أكبر حجمًا باستخدام نفس فترة الحضانة. س: هل يخضع التعبير عن T7 لتثبيط الكاتابوليت في سلالة BL21(DE3) والسلالات المشتقة منها؟ ج: يحمل طليعة العاثية لامدا DE3 جين بوليميراز الحمض النووي الريبي T7 (T7gene1). يتم التحكم في التعبير عن بوليميراز الحمض النووي الريبي T7 بواسطة محفز lacUV5. لذا، ستؤدي إضافة الجلوكوز إلى كبح الاستقلاب، وسيتم التحكم بشكل أفضل في التعبير القاعدي للبروتين من نواقل محفز T7 عند وجود الجلوكوز في الوسط. أما عندما يكون الجلسرين هو المصدر الرئيسي للكربون، فلن يكون هناك أي تأثير على التعبير القاعدي لـ T7.","brand":"New England Biolabs","offers":[{"title":"Default Title","offer_id":46835488456873,"sku":"C2528J","price":0.99,"currency_code":"USD","in_stock":true}],"url":"https:\/\/iright.com\/ar\/products\/neb-c2528j","provider":"Iright","version":"1.0","type":"link"}