{"product_id":"neb-c2992i","title":"نيو إنجلاند بيولابس، C2992I، NEB® 5-alpha F'Iq Competent E. coli (High Efficiency)","description":"هل تواجه صعوبة في فتح الأنابيب؟ \u003cb\u003eالفئات ذات الصلة:\u003c\/b\u003e استنساخ سلالات الخلايا المؤهلة، \u003cb\u003eالتطبيقات:\u003c\/b\u003e حلول الاستنساخ عالية الإنتاجية والأتمتة، \u003cb\u003eمواصفات\u003c\/b\u003e التحويل، المضادات \u003cb\u003eالحيوية لاختيار البلازميد،\u003c\/b\u003e تركيز العمل: أمبيسيلين 100 ميكروغرام\/مل، كاربينيسيلين 100 ميكروغرام\/مل، كلورامفينيكول 33 ميكروغرام\/مل، كاناميسين 30 ميكروغرام\/مل، ستربتوميسين 25 ميكروغرام\/مل، \u003cb\u003eملاحظات الشحن\u003c\/b\u003e : يُشحن على ثلج جاف، \u003cb\u003eالأسئلة الشائعة\u003c\/b\u003e : س: ما هي سلالات الخلايا المؤهلة المتوافقة مع استنساخ Gateway®؟ ج: يمكن استخدام سلالتي الإشريكية القولونية المؤهلة NEB 5-alpha (NEB #C2987) وNEB 10-beta (NEB #C3019) مع استنساخ Gateway. س: هل يؤثر حجم البلازميد على كفاءة التحويل (C2992)؟ ج: نعم. قمنا بتحويل سلسلة من البلازميدات، تتراوح أحجامها بين 2.7 كيلوبايت (pUC19) و24 كيلوبايت، إلى خلايا الإشريكية القولونية المؤهلة NEB 5-alpha F´Iq (NEB #C2992H) وخلايا الإشريكية القولونية المؤهلة NEB 10-beta (NEB #C3019H) جنبًا إلى جنب. لاحظنا أن كفاءة التحويل تتأثر بحجم البلازميد. تُحوَّل خلايا NEB 10-beta المؤهلة كيميائيًا بكفاءة أكبر باستخدام البلازميدات الكبيرة مقارنةً بخلايا NEB 5-alpha F´Iq. س: ما هي المدة المثلى لحضانة الخلايا على الجليد بعد إضافة الحمض النووي (NEB #C2992H وNEB #C2992I)؟ ج: يُوصى بحضانة الحمض النووي مع خلايا NEB 5-alpha F´Iq المؤهلة على الجليد لمدة 30 دقيقة. عند اختبارها مع pUC19، لم تُؤدِّ مدة حضانة 10 دقائق إلى انخفاض ملحوظ في كفاءة التحويل (انظر الشكل في صفحة المنتج الرئيسية). س: كيف أحسب كفاءة التحويل (C2992)؟ ج: تُعرَّف كفاءة التحويل بأنها عدد وحدات تكوين المستعمرات (CFU) التي يمكن إنتاجها بتحويل 1 ميكروغرام من البلازميد إلى حجم معين من الخلايا المؤهلة. قد يكون هذا المصطلح مُضللاً بعض الشيء، إذ نادرًا ما يتم تحويل 1 ميكروغرام من البلازميد فعليًا. بدلاً من ذلك، تُحسب الكفاءة عادةً بتحويل 100 بيكوغرام إلى 1 نانوغرام من البلازميد فائق الالتفاف عالي النقاء في ظل ظروف مثالية. إذا كنت تخطط لحساب الكفاءة لمقارنة الخلايا أو عمليات الربط، فضع في اعتبارك المتغيرات العديدة التي تؤثر على هذا المقياس. معادلة كفاءة التحويل (TE): TE = المستعمرات\/ميكروغرام\/التخفيف، المستعمرات = عدد المستعمرات التي تم عدها على الطبق، ميكروغرام = كمية الحمض النووي المحول معبر عنها بالميكروغرام، التخفيف = التخفيف الكلي للحمض النووي قبل الزرع، مثال على حساب TE: تحويل 2 ميكرولتر (100 بيكوغرام) من الحمض النووي pUC19 للتحكم إلى 50 ميكرولتر من الخلايا، وتنمية الخلايا بإضافة 250 ميكرولتر من SOC وتخفيف 10 ميكرولتر إلى 1 مل في SOC قبل زرع 30 ميكرولتر. إذا قمت بحساب 150 مستعمرة على الطبق، فإنّ TE هو: عدد المستعمرات = 150 ميكروغرام، الحمض النووي = 0.0001، التخفيف = 10\/300 × 30\/1000 = 0.001، TE = 150\/0.0001\/0.001 = 1.5 × 10⁹ وحدة تشكيل مستعمرة\/ميكروغرام. س: ما هي المحاليل\/الوصفات (C2992)؟ ج: SOB: 2% ببتون نباتي (أو تريبتون) 0.5% مستخلص خميرة 10 ملي مولار كلوريد الصوديوم 2.5 ملي مولار كلوريد البوتاسيوم 10 ملي مولار كلوريد المغنيسيوم 10 ملي مولار كبريتات المغنيسيوم SOC: SOB + 20 ملي مولار جلوكوز LB أجار: 1% تريبتون 0.5% مستخلص خميرة 0.17 مولار كلوريد الصوديوم 1.5% أجار الفحص الأزرق\/الأبيض: X-gal 80 ميكروغرام\/مل IPTG* 0.3 ملي مولار *يُحذف IPTG للجينات التي قد تكون سامة س: ما هي خصائص السلالة (C2992)؟ ج: خصائص هذه السلالة التي تُساهم في فائدتها كسلالة استنساخ موصوفة أدناه. تظهر الأنماط الجينية الكامنة وراء هذه الخصائص بين قوسين. الفحص الأزرق\/الأبيض: (F' Δ(lacZ)M15) يُنتج جزء أوميغا من β-gal؛ يؤدي حذف (lac-proAB) إلى حذف جين بيتا-جالاكتوزيداز (β-gal) من الكروموسوم. يشفر البلازميد pUC19 والبلازميدات المشابهة الببتيد ألفا لإنزيم بيتا-جالاكتوزيداز (lacZ). يمكن للببتيد ألفا أن يرتبط بجزء أوميغا من بيتا-جالاكتوزيداز الموجود على الكروموسوم F' (تكميل ألفا). عند إعادة تكوين بيتا-جالاكتوزيداز بهذه الطريقة، فإنه قادر على شطر X-gal، مما ينتج عنه مستعمرات زرقاء على طبق X-gal. تؤدي الإدخالات المستنسخة في منطقة الربط المتعددة للبلازميد إلى تعطيل جين الببتيد ألفا، فتصبح المستعمرات بيضاء. نقص إعادة التركيب: (recA1) تمتلك بكتيريا الإشريكية القولونية نظام إصلاح يعيد تركيب التسلسلات المتماثلة. غالبًا ما تحتوي المستنسخات الجينومية على مناطق مكررة، وقد تكون عمليات إعادة الترتيب التي يتوسطها RecA إشكالية، خاصةً عندما يزيد طول مناطق التماثل عن 50 زوجًا قاعديًا. تميل السلالات التي حُذفت منها وظيفة RecA إلى النمو ببطء أكبر من سلالات recA+. نقص الإندونوكلياز I: (endA1) يحتوي الحيز المحيط بالبلازما في خلايا الإشريكية القولونية من النوع البري على إندونوكلياز غير متخصص. يجب توخي الحذر الشديد لتجنب تحلل البلازميدات المُحضّرة من هذه الخلايا. تؤدي طفرة endA إلى حذف هذا الإندونوكلياز، ويمكنها تحسين جودة تحضيرات البلازميد بشكل ملحوظ. نقص في التقييد: (hsdR17) تحمل سلالات الإشريكية القولونية K12 من النوع البري إنزيمًا داخليًا مقيدًا يقطع الحمض النووي في المواقع (AAC(N6)GTGC وGCAC(N6)GTT). على الرغم من أن الحمض النووي للإشريكية القولونية محمي من التحلل بواسطة ناقل ميثيل خاص به، إلا أن الحمض النووي الغريب سيُقطع في هذه المواقع. طفرة hsdR تقضي على نشاط هذا الإنزيم الداخلي. مع ذلك، تمتلك هذه السلالة أنظمة تقييد ميثيل فعالة، وقد لا تكون مناسبة للاستنساخ المباشر للحمض النووي حقيقي النواة. حساسة لفيروس M13: (F´) يتطلب الإصابة بفيروس M13 وغيره من الفيروسات المماثلة خصائص سطحية للإشريكية القولونية يمنحها البلازميد F الذي تحمله بعض سلالات الإشريكية القولونية. تسمح الإصابة بهذه الفيروسات بإنتاج الحمض النووي أحادي السلسلة وإنشاء مكتبات عرض الفيروسات. غالبًا ما يُعدَّل البلازميد F لحمل حمض نووي مفيد آخر في الخلية [مثل Δ(lacZ)M15 في هذا الخط الخلوي]. وعند تعديله يُسمى F´. مقاومة العاثية T1: (fhuA2) تتطلب العاثية T1، وهي عاثية شديدة الضراوة، مستقبل امتصاص هيدروكسامات الحديديك في بكتيريا الإشريكية القولونية لكي تُصيب الخلايا. يُكسب حذف هذا الجين مقاومةً لهذا النوع من العاثيات، ولكنه لا يؤثر بشكل كبير على خصائص التحول أو نمو الخلية. التحكم في مُحفز اللاكتوز: (lacIq) يمنع مثبط اللاكتوز التعبير من مُحفزات اللاكتوز، والتاك، والترس التي تحملها عادةً بلازميدات التعبير. إذا لم يكن مستوى مثبط اللاكتوز في خلايا الإشريكية القولونية كافيًا لتثبيط التعبير عبر هذه المُحفزات أثناء التحول أو نمو الخلية، فإن حتى المستويات المنخفضة من التعبير يمكن أن تُقلل من كفاءة التحول وتؤدي إلى استبعاد المُتحولات المرغوبة. تُساعد جزيئات مثبط اللاكتوز الإضافية في سلالات lacIq على تقليل نشاط المُحفز إلى الحد الأدنى حتى إضافة IPTG. DH5α™ هي علامة تجارية لشركة Invitrogen. س: ما الفرق بين NEB #C2992H وNEB #C2992I؟ ج: هما نفس الخلايا بنفس الكفاءة، لكنهما متوفرتان بأشكال مختلفة. تأتي سلالة C2992H في عبوة تحتوي على 20 أنبوب تحويل للاستخدام لمرة واحدة، يحتوي كل منها على 50 ميكرولتر من الخلايا المؤهلة. يمكن إضافة البلازميد أو ناتج الربط مباشرةً إلى أنابيب التحويل لسهولة الاستخدام. أما سلالة C2992I فتأتي في عبوة تحتوي على 6 أنابيب، يحتوي كل منها على 200 ميكرولتر من الخلايا المؤهلة. يجب إذابة الأنابيب على الجليد ونقل 50 ميكرولتر من الخلايا إلى أنابيب جديدة قبل التحويل. يحتوي كل أنبوب على عدد كافٍ من الخلايا لإجراء 4 عمليات تحويل، مما يقلل من تكلفة كل عملية. إذا كنت تجري 3 أو 4 عمليات تحويل في المرة الواحدة، فإن استخدام سلالة C2992I يُعدّ خيارًا اقتصاديًا. لا يُنصح بإعادة تجميد الخلايا المؤهلة بعد إذابتها لأن ذلك سيقلل بشكل كبير من كفاءة التحويل. س: ما هو الوقت الأمثل للصدمة الحرارية لهذه السلالة (NEB #C2992H وNEB #C2992I)؟ ج: صدمة حرارية عند 42 درجة مئوية لمدة يؤدي استخدام 30 ثانية إلى أعلى كفاءة تحويل لبكتيريا الإشريكية القولونية المؤهلة NEB 5-alpha F´Iq (NEB #C2992H وNEB #C2992I). توقع انخفاضًا بنسبة 70% تقريبًا في كفاءة التحويل عند تعريضها لصدمة حرارية لمدة 80 ثانية (انظر الشكل في صفحة المنتج الرئيسية). س: أي سلالة من بكتيريا الإشريكية القولونية المؤهلة يجب أن أستخدمها للاستنساخ العام؟ ج: بكتيريا الإشريكية القولونية المؤهلة NEB 5-alpha (NEB #C2987) هي مشتق عالي الكفاءة من DH5α™، وهي سلالة الاستنساخ القياسية في هذا المجال. تسمح بكتيريا الإشريكية القولونية المؤهلة NEB Turbo (NEB #C2984) وNEB 5-alpha F´Iq (NEB #C2992) باستنساخ الجينات التي قد تكون سامة نظرًا للتحكم الدقيق في التعبير بواسطة lacIq، وهما مناسبتان للفحص الأزرق\/الأبيض. توفر بكتيريا الإشريكية القولونية المؤهلة NEB Turbo (NEB #C2984) سرعة لا تُضاهى في عمليات التحويل، مع ظهور مستعمرات مرئية بعد 6.5 ساعات فقط، وإمكانية تحضير البلازميد بعد 4 ساعات. تُعدّ بكتيريا الإشريكية القولونية NEB 10-beta Competent E. coli (NEB #C3019) مشتقة من DH10B™، ويمكن استخدامها لتحويل البلازميدات الكبيرة وBACs. يمكن استخدام بكتيريا الإشريكية القولونية Dam-\/dcm- Competent E. coli (NEB #C2925) لنمو البلازميدات دون مثيلة. إذا تأثرت كفاءة الاستنساخ سلبًا بعناصر الحمض النووي المتكررة في الناقل أو تسلسل الإدخال، يُوصى باستخدام بكتيريا الإشريكية القولونية NEB Stable Competent E. coli (NEB #C3040). (راجع بروتوكول استنساخ الحمض النووي الذي يحتوي على عناصر متكررة). لست متأكدًا من سلالة الاستنساخ المناسبة؟ تتيح لك أداة أخذ عينات بكتيريا الإشريكية القولونية NEB Cloning Competent E.coli Sampler (NEB #C1010) أخذ عينات من 4 من سلالاتنا الكيميائية المؤهلة الشائعة. سؤال: هل يمكنني تخزين الخلايا المؤهلة عند -20 درجة مئوية بدلًا من -80 درجة مئوية؟ ج: يجب تخزين الخلايا المؤهلة عند درجة حرارة -80 درجة مئوية. سيؤدي التخزين عند درجة حرارة -20 درجة مئوية إلى انخفاض كبير في كفاءة التحويل (TE). عند اختبارها على بكتيريا الإشريكية القولونية المؤهلة NEB 5-alpha (NEB #C2987H)، فقدت الخلايا 94.5% من كفاءة التحويل بعد 24 ساعة فقط من التخزين عند درجة حرارة -20 درجة مئوية. فقدت الخلايا 98.9% من كفاءة التحويل بعد يومين، و99.6% بعد أسبوع واحد من التخزين عند درجة حرارة -20 درجة مئوية. س: ما نوع أنابيب التحويل التي يجب استخدامها؟ ج: بالمقارنة مع الأنبوب سعة 2.0 مل المرفق مع خلايا NEB المؤهلة للاستخدام لمرة واحدة، فإن أنبوب إيبندورف سعة 1.5 مل الذي اختبرناه كان مناسبًا تمامًا. س: ما حجم الحمض النووي الذي يمكن إضافته إلى الخلايا المؤهلة؟ ج: يؤثر حجم الحمض النووي المراد إضافته إلى الخلايا المؤهلة على كفاءة التحويل. يوصى باستخدام 1-5 ميكرولتر من الحمض النووي (بلازميد أو ناتج ربط) لكل 50 ميكرولتر من الخلايا المؤهلة الخلايا. في 50 ميكرولتر من الخلايا المؤهلة، تنخفض كفاءة التحويل إلى 52% عند زيادة حجم الحمض النووي إلى 10 ميكرولتر (من 2 ميكرولتر). وتنخفض كفاءة التحويل إلى 18% عند زيادة حجم الحمض النووي إلى 20 ميكرولتر (من 2 ميكرولتر). وتنخفض كفاءة التحويل إلى 5.2% عند زيادة حجم الحمض النووي إلى 50 ميكرولتر (من 2 ميكرولتر). س: ما هي مدة صلاحية هذه السلالة (NEB #C2992H وNEB #C2992I)؟ ج: تاريخ انتهاء الصلاحية هو سنة واحدة من تاريخ التحليل المرفق مع المنتج. س: هل خلايا NEB المؤهلة متوافقة مع بروتوكول \"Mix \u0026amp; Go\"؟ ج: يوجد بروتوكول \"Mix and Go\" يوفر طريقة سريعة لتحويل خلاياك ببساطة عن طريق إضافة البلازميد إلى الخلايا وزرعها. لا حاجة لخطوة الصدمة الحرارية. اختبرت NEB خلاياها المؤهلة في هذا البروتوكول مقابل منتج \"Mix \u0026amp; Go\" لشركة أخرى. لاحظتُ أن كلا الوسطين يُنتجان أعدادًا متقاربة من المستعمرات؛ إلا أن مستعمرات NEB تكون أكبر حجمًا عند استخدام نفس فترة الحضانة. س: كيف يُمكنني تخزين وسط نمو الخلايا SOC؟ يُوصي مُنتج SOC الذي استلمته مع خلاياي المُؤهلة بالتخزين إما في درجة حرارة الغرفة أو 4 درجات مئوية، ولكن عند شرائه كمنتج مُنفصل، يُوصي بتخزينه في درجة حرارة 4 درجات مئوية. أيّهما أفضل؟ ج: يُمكن تخزين وسط SOC في درجة حرارة 4 درجات مئوية أو درجة حرارة الغرفة حسب سرعة استخدامه. يُعد التخزين في درجة حرارة الغرفة مُناسبًا وكافيًا للاستخدام قصير المدى (من أسابيع إلى شهرين). للتخزين طويل المدى، نُوصي بالتخزين في درجة حرارة 4 درجات مئوية. يُرجى مُلاحظة أن وسط نمو الخلايا 1.5 المُرفق مع NEB #C2987R (لوحة 384 بئرًا) يجب تخزينه في درجة حرارة الغرفة فقط وإلا ستتكون بلورات. س: كيف يُمكن تحضير القطع للتجميع باستخدام NEBuilder HiFi؟ ج: يُمكن تحضير القطع بالطرق التالية: يُمكن تنظيف القطع المُنتجة بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). باستخدام عمود Monarch PCR أو مجموعة Exo-CIP Rapid PCR Cleanup Kit إذا كانت نقاوة المُضخَّم أعلى من 95%. في حال استخدام الحمض النووي البلازميدي كقالب أثناء تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR)، يمكن إزالته بمعالجة DpnI عند الضرورة. في حال ظهور حزم متعددة، نوصي بتحسين تفاعل البلمرة المتسلسل. إذا لم يكن ذلك ممكنًا، يُوصى بتنقية الجل. قد يُؤدي استخلاص الجل إلى إدخال غوانيدين ثيوسيانات (من محلول الإذابة) مما قد يُقلل من كفاءة تفاعل التجميع. لتقليل هذا التلوث، يُنصح بتقليم شريحة الجل بحيث يُمكن استخدام كمية أقل من محلول إذابة الجل. يُمكن إجراء هضم البلازميد باستخدام إنزيمات التقييد، يليه تعطيله بالحرارة أو تنقيته باستخدام العمود. يُمكن إعادة تعليق القطع المطلوبة تجاريًا في ماء خالٍ من النيوكلياز أو محلول TE واستخدامها مباشرةً في تفاعل التجميع.","brand":"New England Biolabs","offers":[{"title":"Default Title","offer_id":46835518931113,"sku":"C2992I","price":0.99,"currency_code":"USD","in_stock":true}],"url":"https:\/\/iright.com\/ar\/products\/neb-c2992i","provider":"Iright","version":"1.0","type":"link"}