{"product_id":"neb-e1202s","title":"مجموعة استنساخ تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) من نيو إنجلاند بيولابس، E1202S، NEB®","description":"سهولة استنساخ جميع منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)، بما في ذلك النهايات غير المتداخلة ونهايات TA. \u003cb\u003eالفئات ذات الصلة:\u003c\/b\u003e تجميع الحمض النووي، مجموعات الاستنساخ والطفرات. \u003cb\u003eالمواصفات:\u003c\/b\u003e \u003cb\u003eملاحظات التخزين:\u003c\/b\u003e تُشحن المجموعة على ثلج جاف. عند الاستلام، تُخزن الخلايا المؤهلة (في الصندوق الخارجي الكبير) عند درجة حرارة -80 درجة مئوية، والمكونات في الصندوق الداخلي الصغير عند درجة حرارة -20 درجة مئوية، ووسط النمو NEB™ 10-beta\/Stable Outgrowth Medium في درجة حرارة الغرفة أو 4 درجات مئوية. \u003cb\u003eالأسئلة الشائعة\u003c\/b\u003e : س: كيف تعمل مجموعة استنساخ تفاعل البوليميراز المتسلسل NEB®؟ ج: يصعب على بكتيريا الإشريكية القولونية معالجة إطارات القراءة المفتوحة التي تشفر 5 أحماض أمينية أو أقل (2،3). تؤدي هذه الجينات الصغيرة، أو الجينات المصغرة، إلى إطلاق مبكر للببتيد الصغير جدًا من الريبوسوم، مع بقاء آخر حمض أميني مرتبطًا تساهميًا بجزيء tRNA الخاص به، بحيث لا يكون tRNA متاحًا بسهولة لتخليق البروتين. إذا أعاد ناقل pMiniT 2.0 تدوير نفسه بدون إدخال، فسيؤدي ذلك إلى تثبيط مميت لتخليق البروتين ولن تتكون أي مستعمرة. إذا كان ناقل pMiniT 2.0 يحمل قطعة مُدرجة، فستنمو مستعمرة. س: كيف يعمل ناقل الاستنساخ مع كلٍ من القطع المُضخمة ذات النهايات غير المتداخلة والقطع المُضخمة التي تحتوي على قاعدة واحدة بارزة؟ ج: تحتوي الخلطات على مكونات تلميع النهايات التي تُحوّل القواعد الواحدة البارزة، مثل تلك الموجودة في القطع المُضخمة المُنتجة بواسطة بوليميراز Taq DNA أو الخلطات القائمة على Taq، إلى نهايات غير متداخلة. بعد ذلك، يُمكن ربط شكل النهاية غير المتداخلة بناقل pMiniT 2.0. س: هل تُؤثر مكونات التلميع الموجودة في الخلطة الرئيسية على كفاءة الاستنساخ إذا كانت القطعة المُدرجة تحتوي بالفعل على نهايات غير متداخلة؟ ج: لا. تم تحسين تركيزات مكونات تلميع النهايات بعناية بحيث تتم إزالة أي قواعد واحدة بارزة لتكوين نهايات غير متداخلة؛ ولا تتأثر منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) ذات النهايات غير المتداخلة. س: هل يجب أن تحتوي القطع المُدرجة على فوسفات 5'؟ ج: لا، تعمل استراتيجية الاستنساخ هذه بكفاءة مع القطع المُدخلة سواءً احتوت على مجموعات فوسفات في الطرف 5' أم لا. في الواقع، استخدام بادئات غير مُفسفرة لتفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) يمنع إمكانية استنساخ قطع مُدخلة متعددة في ناقل pMiniT 2.0. س: هل يمكن استخدام مجموعة الاستنساخ مع القطع المُدخلة التي ليست بالضرورة نواتج تضخيم PCR؟ ج: نعم، تعمل المجموعة بكفاءة متساوية مع قطع التقييد ذات النهايات غير المتداخلة وقطع التقييد ذات القاعدة الواحدة المتدلية، أو مع الحمض النووي الاصطناعي. س: هل يمكن استخدام مجموعة الاستنساخ مع القطع المُدخلة التي تحتوي على امتدادات في الطرف 5' أو 3' أكبر من امتداد القاعدة الواحدة الذي يتم الحصول عليه بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) باستخدام بوليميراز Taq DNA؟ ج: نعم، ولكن بكفاءة أقل. تم تحسين مكونات التلميع لإزالة امتداد القاعدة الواحدة. كمثال اختباري متطرف، أدى استنساخ قطعة من الحمض النووي تحتوي على نتوء 5' بطول 4 قواعد يتطلب ملء الفراغات، ونتوء 3' بطول 5 قواعد يتطلب إزالة النهايات، إلى عدد أقل بعشرة أضعاف من المتحولات مقارنةً بقطع الحمض النووي ذات النهايات غير المتداخلة أو ذات النتوءات أحادية القاعدة. س: هل يمكنني استخدام مجموعة استنساخ NEB PCR التي تحتوي على pMiniT 2.0 لتجميع Golden Gate؟ ج: لا يحتوي pMiniT 2.0 على مواقع BsaI، لذا يمكن استخدامه لاستنساخ وحدات Golden Gate التي تحتوي على مواقع BsaI. س: هل يحتاج ناتج تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) إلى التنقية؟ ج: لا، على الرغم من أن كفاءة التحويل تتحقق باستخدام قطع مُدخلة مُنقّاة. في حال استخدام نواتج تضخيم PCR غير مُنقّاة، استخدم 1 ميكرولتر أو أقل من ناتج PCR كمادة مُدخلة لتحقيق نسبة مولية 3:1 بين القطعة المُدخلة والناقل. من المهم للغاية، خاصةً في تفاعلات البلمرة المتسلسلة عالية الإنتاجية، تجنب إضافة كمية كبيرة من القطعة المُدخلة، لأن ذلك قد يؤدي إلى ربطها بطرفي هيكل الناقل. س: هل يمكنني استخدام سلالة مختلفة من بكتيريا الإشريكية القولونية المؤهلة عن سلالة NEB 10-beta المرفقة؟ ج: على الرغم من أن نظام الاستنساخ هذا يعمل بكفاءة مع مجموعة متنوعة من سلالات الخلايا، فمن المهم استخدام سلالة ذات نمو قوي للحفاظ على ضغط الانتقاء تجاه تركيبات البلازميد التي تحتوي على القطعة المُدخلة. بالإضافة إلى سلالة NEB 10-beta المؤهلة من بكتيريا الإشريكية القولونية (كفاءة الاستنساخ) المرفقة في مجموعة استنساخ تفاعل البلمرة المتسلسلة من NEB (NEB #E1202)، تشمل سلالات الخلايا التي تعمل بكفاءة مع هذه المجموعة سلالتي NEB Turbo (NEB #C2984) وNEBExpress (NEB #C2523) من بكتيريا الإشريكية القولونية المؤهلة. لا يُنصح باستخدام سلالات 5-alpha، لأن معدل نموها الأبطأ قليلاً لا يدعم كبحًا قويًا للخلفية. س: كيف يمكنني زيادة عدد الخلايا المُحوَّلة إلى أقصى حد؟ ج: استخدم الفترات الزمنية الأطول المقترحة لخطوات البروتوكول. إذا رغبت، ضع 50 ميكرولتر إضافية من ناتج النمو (1 مل) على أطباق إضافية، ولكن لا تضع أكثر من 50 ميكرولتر لكل طبق للحفاظ على مستوى منخفض من الخلفية. س: هل يمكنني تقليل حجم التفاعلات لاستخدام كمية أقل من الناقل؟ ج: يمكن تقليل كمية الناقل المستخدمة لكل تفاعل من 25 نانوغرام إلى 10 نانوغرام. قلل كمية الإدخال بشكل متناسب للحفاظ على النسبة المولية المثلى 3:1 بين الإدخال والناقل، وكذلك كمية مزيج الاستنساخ 1 ومزيج الاستنساخ 2 المضافة. س: هل هناك حدود لحجم الإدخالات التي يمكن استنساخها؟ ج: يدعم NEB 10-beta استقرار البلازميدات الكبيرة، ويسمح الحجم الصغير لـ pMiniT باستنساخ الإدخالات الكبيرة. تم استنساخ إدخالات بحجم 4-5 كيلوبايت بسهولة. لاحظ أن الإدخالات الأكبر قد تتطلب نسبًا أقل بين الإدخال والناقل. س: هل خلايا الإشريكية القولونية NEB 10-beta المؤهلة (كفاءة الاستنساخ) المتوفرة في المجموعة هي نفسها خلايا الإشريكية القولونية NEB 10-beta المؤهلة (الكفاءة العالية)؟ ج: الخلايا متطابقة، لكنها تختلف عشرة أضعاف في كفاءة التحويل. تشير اختباراتنا إلى أن مستوى كفاءة الاستنساخ المُقدم يدعم نتائج ممتازة لاستنساخ مُضخّمات تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). س: كيف يمكنني تحديد ما إذا كانت خلايا NEB 10-beta الخاصة بي مؤهلة؟ ج: يُقدم الحمض النووي pUC19 المُتحكم به في المجموعة في حال رغب المستخدم في تأكيد كفاءة خلايا الإشريكية القولونية NEB 10-beta المؤهلة المُقدمة. مع أن هذا ليس مطلوبًا بشكل روتيني، يمكن تأكيد كفاءة التحويل بشكل مستقل عن طريق تحويل 100 بيكوغرام (2 ميكرولتر من المحلول المركز بتركيز 50 بيكوغرام\/ميكرولتر) إلى 50 ميكرولتر من الخلايا المؤهلة واتباع بروتوكولات التحويل والزرع المعتادة. يجب أن تكون كفاءة التحويل الناتجة أكبر من 1 × 10⁸ وحدة تشكيل مستعمرة\/ميكروغرام من حمض pUC19 النووي. س: هل يمكن خلط مزيج الاستنساخ 1 ومزيج الاستنساخ 2 معًا قبل إضافتهما إلى تفاعل الربط؟ ج: يمكن خلط مزيج الاستنساخ 1 ومزيج الاستنساخ 2 قبل بدء التفاعل. للتخزين طويل الأمد، يجب تخزين مزيج الاستنساخ 1 ومزيج الاستنساخ 2 في قوارير منفصلة. سيؤدي تخزين مزيج الاستنساخ 1 ومزيج الاستنساخ 2 المختلط معًا إلى انخفاض نشاط الإنزيم. س: أين تقع مواقع النسخ +1 لمُحفِّزَي SP6 وT7 للنسخ والترجمة في المختبر؟ ج: يقع موقع +1 لمُحفِّز SP6 على بُعد 50 زوجًا قاعديًا قبل موقع الاستنساخ لنسخ الإدخالات المستنسخة باتجاه عقارب الساعة، بينما يقع موقع +1 لمُحفِّز T7 على بُعد 62 زوجًا قاعديًا بعد موقع الاستنساخ لنسخ الإدخالات المستنسخة باتجاه عكس عقارب الساعة. س: ما الفرق بين ناقل pMiniT الأصلي وناقل pMiniT 2.0 الخطي المتوفر حاليًا في المجموعة؟ ج: يتميز الإصدار 2.0 بثلاثة تحسينات: إضافة تسلسلات محفزات بوليميراز الحمض النووي الريبي T7 وSP6 المحيطة بموقع الاستنساخ لنسخ الإدخالات المستنسخة في المختبر. إضافة سبعة مواقع تقييد جديدة، بما في ذلك أربعة مواقع إنزيمات تقييد للتعرف على 8 قواعد محيطة بموقع الاستنساخ لتسهيل عملية التخطيط الخطي بعد الإدخال المستنسخ لدراسات النسخ، ولزيادة خيارات استراتيجيات الاستنساخ الفرعي. إزالة موقع BsaI الموجود في جين ApR من خلال الطفرات الموجهة للموقع لتسهيل استخدام الإدخالات\/الوحدات المستنسخة في تجميع Golden Gate. يتمتع كلا الإصدارين من ناقل pMiniT الخطي بنفس الوظائف في مجموعة الاستنساخ. س: عند استنساخ قطعة PCR في ناقل pMiniT 2.0 المرفق مع مجموعة استنساخ NEB PCR، أين يتم ربط القطعة المُدخلة في موقع الاستنساخ المتعدد (MCS) الخاص بالناقل؟ ج: يتم ربط القطعة المُدخلة بين النيوكليوتيدات 545 و546 من ناقل pMiniT 2.0. تقع نقطة الإدخال هذه بين مواقع التعرف على إنزيمي EcoRi وPacI في منطقة MCS الخاصة بالناقل.","brand":"New England Biolabs","offers":[{"title":"Default Title","offer_id":46835492323497,"sku":"E1202S","price":0.99,"currency_code":"USD","in_stock":true}],"url":"https:\/\/iright.com\/ar\/products\/neb-e1202s","provider":"Iright","version":"1.0","type":"link"}