{"product_id":"neb-e2611s","title":"نيو إنجلاند بيولابس، E2611S، مزيج جيبسون أسيمبلي® الرئيسي","description":"تمت إعادة صياغة مزيج جيبسون الرئيسي للتجميع بمكونات تحتوي على الألبومين المؤتلف (rAlbumin) بدءًا من رقم الدفعة 10229799. \u003cb\u003eالفئات ذات الصلة:\u003c\/b\u003e مجموعات تجميع الحمض النووي، والاستنساخ، والطفرات. \u003cb\u003eالتطبيقات:\u003c\/b\u003e \u003cb\u003eمواصفات\u003c\/b\u003e تجميع جيبسون \u003cb\u003e. المواد المطلوبة (غير المرفقة)\u003c\/b\u003e : خيارات بوليميراز الحمض النووي الموصى بها لتفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR): بوليميراز الحمض النووي عالي الدقة Q5® (NEB #M0491)، بوليميراز الحمض النووي Q5 Hot Start Flex (NEB #M0493)، مزيج Q5 Hot Start Flex 2X Master Mix (NEB #M0494)، أطباق LB (لوريا-بيرتاني) مع المضاد الحيوي المناسب، وسط نمو SOC (NEB #B9020). خيارات الخلايا المؤهلة للتحويل: بكتيريا الإشريكية القولونية المؤهلة NEB 5-alpha (عالية الكفاءة، NEB #C2987)، بكتيريا الإشريكية القولونية المؤهلة NEB 10-beta (عالية الكفاءة، NEB #C3019) (موصى بها للمنتجات المجمعة التي يزيد حجمها عن 10 كيلوبايت)، بكتيريا الإشريكية القولونية المؤهلة كهربائيًا NEB 10-beta (NEB #C3020). \u003cb\u003eملاحظات تخزين\u003c\/b\u003e بكتيريا الإشريكية القولونية NEB® Stable Competent E. coli (عالية الكفاءة) (NEB #C3040): يُحفظ في درجة حرارة -20 درجة مئوية. يُذاب ويُرج جيدًا قبل الاستخدام ويُحفظ على الثلج. \u003cb\u003eالأسئلة الشائعة\u003c\/b\u003e : س: لست متأكدًا مما إذا كان عليّ اختيار NEBuilder HiFi DNA Assembly أو NEB Gibson Assembly؟ ما الفرق بين المنتجين؟ ج: يوفر NEBuilder HiFi DNA Assembly العديد من المزايا مقارنةً بـ NEB Gibson Assembly. يستخدم NEBuilder HiFi بوليميرازًا عالي الدقة خاصًا به، مما يقلل من الحاجة إلى فحص\/إعادة تسلسل التركيبات، ويؤدي إلى تجميع عالي الدقة وخالٍ من الأخطاء تقريبًا. تُمكّن هذه الميزة أيضًا من استخدام NEBuilder في تطبيقات معينة لا يُمكن استخدام NEB Gibson Assembly فيها: يُزيل NEBuilder HiFi عدم تطابق النهايات 5' و3'، ويمكن استخدامه في جولات متتالية من التجميع. هذا يوفر الوقت عن طريق تجنب خطوات تضخيم PCR التي تستغرق وقتًا طويلاً. يُمكن لتقنية NEBuilder HiFi ربط قطعتين من الحمض النووي المزدوج (ds-fragments) باستخدام أوليغونوكليوتيد أحادي السلسلة (ssDNA) اصطناعي، مما يُتيح بناءً بسيطًا وسريعًا (مثل إدخال رابط أو مكتبة gRNA). لمزيد من المعلومات والبيانات التفصيلية، يُرجى زيارة NEBuilderHifi.com. س: ما هي مزايا هذه الطريقة مقارنةً بطرق الاستنساخ التقليدية؟ ج: تسمح تقنية تجميع جيبسون بإدخال قطعة واحدة أو أكثر من الحمض النووي في أي موضع تقريبًا من المتجه الخطي، ولا تعتمد على وجود مواقع تقييد ضمن تسلسل معين يتم تصنيعه أو استنساخه. وبالتالي، يتمتع المستخدم بتحكم كامل في ما يتم تجميعه، ويمكن تجنب إدخال تسلسل إضافي غير مرغوب فيه، والذي يُستخدم غالبًا لتسهيل معالجة تسلسلات الحمض النووي المتعددة. علاوة على ذلك، تُعد طريقة تجميع جيبسون سريعة نسبيًا مقارنةً بالاستنساخ القياسي القائم على إنزيمات التقييد. وأخيرًا، يُمكن ربط عدد أكبر من قطع الحمض النووي في تفاعل واحد بكفاءة أعلى من الطرق التقليدية. س: ما هو أكبر حجم لقطعة الحمض النووي التي يُمكنني تجميعها؟ ج: تم استخدام مجموعة استنساخ جيبسون (التي تحتوي على بكتيريا الإشريكية القولونية NEB 5-alpha Competent E. coli) بنجاح لاستنساخ قطعة DNA بطول 15 كيلوبايت في بلازميد بطول 5.4 كيلوبايت في بكتيريا الإشريكية القولونية، ليصل الطول الإجمالي إلى 20.4 كيلوبايت. مع ذلك، وكقاعدة عامة للمنتجات المُجمَّعة التي يزيد طولها عن 10 كيلوبايت، توصي شركة NEB باستخدام بكتيريا الإشريكية القولونية NEB 10-beta Competent E. coli (عالية الكفاءة، NEB #C3019) أو بكتيريا الإشريكية القولونية NEB 10-beta Electrocompetent E. coli (NEB #C3020). س: كم عدد قطع DNA التي يمكن تجميعها في تفاعل واحد؟ ج: يعتمد عدد قطع DNA التي يمكن تجميعها في تفاعل واحد على طول القطع وتسلسلها. وقد استُخدمت تقنية جيبسون لتجميع ما يصل إلى 12 قطعة DNA مُدرجة بطول 0.4 كيلوبايت بكفاءة في ناقل واحد في وقت واحد. مع ذلك، نوصي بتجميع خمسة أجزاء أو أقل في ناقل واحد في تفاعل واحد لإنتاج نسخة مستنسخة تحتوي على الجزء الصحيح. يمكن استخدام استراتيجية التجميع المتسلسل إذا تعذر تجميع جميع الأجزاء في تفاعل واحد. بدلاً من ذلك، يُنصح باستخدام تجميع البوابة الذهبية لتجميع أكثر من 6 أجزاء. س: ما أقصر تداخلات يمكن استخدامها مع طريقة التجميع هذه؟ ج: تم تحقيق تجميع فعال لأجزاء الحمض النووي بتداخل لا يقل عن 12 زوجًا قاعديًا، ولكن ذلك يعتمد على محتوى GC للتداخل. نوصي باستخدام تداخلات لا تقل عن 15 زوجًا قاعديًا، أو أكثر، لتجميع الحمض النووي المزدوج مع درجة انصهار (Tm) ≥ 48 درجة مئوية (زوج AT = 2 درجة مئوية وزوج GC = 4 درجات مئوية). كما أن زيادة طول التداخل بين الأجزاء يقلل من كمية الحمض النووي اللازمة للتجميع. س: ما أطول تداخلات يمكن استخدامها مع هذه الطريقة؟ ج: تم تحسين كمية الإكسونوكلياز في مزيج جيبسون الرئيسي لتجميع جزيئات الحمض النووي ذات تداخلات ≤ 100 زوج قاعدي. س: هل يمكن تجميع شظايا الحمض النووي المزدوج ≤ 200 زوج قاعدي بهذه الطريقة؟ ج: نعم. للحصول على أفضل النتائج، استخدم كل شظية أصغر بزيادة مولية ≥ 5 أضعاف عن الناقل (نسبة 5:1 بين الشظية المُدخلة والناقل)، وحافظ على إجمالي كمية الحمض النووي في تفاعل جيبسون بين 0.02 و0.5 بيكومول. س: هل يمكن دمج وتجميع قليل النوكليوتيدات أحادي السلسلة من الحمض النووي مع شظايا الحمض النووي المزدوج؟ ج: نعم. ومع ذلك، يجب تحديد التركيز الأمثل لكل قليل النوكليوتيدات. كنقطة بداية، نوصي باستخدام 45 نانومول من كل قليل النوكليوتيدات الذي يقل عن أو يساوي اثني عشر قليل النوكليوتيدات مكونة من 60 قاعدة تحتوي على تداخلات 30 قاعدة. س: هل يمكن استخدام فترات حضانة أطول أو أقصر؟ ج: نعم. لتجميع 2-3 أجزاء، تكفي فترة حضانة 15 دقيقة. لتجميع 4-6 أجزاء، يُنصح بفترة حضانة 60 دقيقة. لا يُنصح عمومًا بفترات تفاعل أقل من 15 دقيقة. وقد ثبت أن فترات الحضانة الممتدة (حتى 4 ساعات) تُحسّن كفاءة التجميع في بعض الحالات. لا تحضّن التفاعل طوال الليل. س: هل يعمل التفاعل عند درجات حرارة أخرى؟ ج: تم تحسين التفاعل عند 50 درجة مئوية، ولكن ثبت أنه يعمل بين 40 و50 درجة مئوية. س: هل من الضروري تعطيل إنزيمات التقييد بعد هضم الناقل؟ ج: تعطيل إنزيمات التقييد ليس ضروريًا عمومًا، ولكنه قد يزيد من كفاءة التحويل في بعض الحالات. إذا كان الجزء المُدخل يحمل أيضًا موقع التقييد الذي استُخدم لتخطيط الناقل، فمن الضروري تعطيل إنزيم التقييد بالحرارة قبل مزج الناقل المُخطط مع الجزء المُدخل في عملية تجميع جيبسون. إذا استُخدم إنزيم تقييد مقاوم للحرارة لتخطيط الناقل، فيجب تنقية الناقل باستخدام أعمدة الحمض النووي، أو استخلاص الفينول-الكلوروفورم، أو استخلاصه من هلام الأغاروز بعد الفصل الكهربائي، قبل ملامسته للقطعة المُدخلة. س: أرغب في إنتاج شظايا متداخلة من الحمض النووي المزدوج (dsDNA) باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). هل أحتاج إلى استخدام بادئات PCR مُنقّاة بواسطة الفصل الكهربائي الهلامي متعدد الأكريلاميد (PAGE) أو كروماتوغرافيا السائل عالي الأداء (HPLC)؟ ج: لا. يمكن استخدام البادئات القياسية المُزالة الأملاح. س: أرغب في تجميع قليل النوكليوتيدات من الحمض النووي أحادي السلسلة (ssDNA) في شظايا من الحمض النووي المزدوج (dsDNA). هل أحتاج إلى استخدام قليل النوكليوتيدات مُنقّاة بواسطة الفصل الكهربائي الهلامي متعدد الأكريلاميد (PAGE) أو كروماتوغرافيا السائل عالي الأداء (HPLC)؟ ج: لا. يمكن استخدام البادئات القياسية المُزالة الأملاح. لمزيد من المعلومات، يُرجى تنزيل مذكرة التطبيق: \"بناء ناقل تعبير sgRNA-Cas9 عبر ربط قليل النوكليوتيدات من الحمض النووي أحادي السلسلة بشظايا الحمض النووي المزدوج\". س: هل يمكنني استخدام تداخل بطول 15 نيوكليوتيدًا يتكون بالكامل من تكرارات علامة الهيستيدين (مثل CACCACCACCACCAC)؟ ج: لا، بعد علامة الهيستيدين، يجب تضمين 3 نيوكليوتيدات على الأقل، لا تُعد جزءًا من تسلسل تكرار علامة الهيستيدين. تجنب تكرار التسلسلات في نهاية التداخل. س: هل يمكن تضخيم المنتج المُجمَّع باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)؟ ج: نعم. جزيء الحمض النووي المُجمَّع مرتبط تساهميًا ويمكن تضخيمه باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). بالإضافة إلى ذلك، إذا كان المنتج النهائي جزيء حمض نووي دائري مغلق، فيمكن استخدامه كقالب في تضخيم الدائرة المتدحرجة (RCA). س: ماذا أفعل إذا لم ينتج عن تفاعل التجميع أي مستعمرات، أو عدد قليل من المستعمرات، أو مستنسخات ذات حجم إدخال غير صحيح بعد التحويل إلى بكتيريا الإشريكية القولونية؟ ج: قم بتجميع وتحويل عنصر التحكم الموجب المُرفق مع مزيج جيبسون الرئيسي للتجميع. سيُثبت التجميع الناجح لعنصر التحكم الموجب أن مزيج التجميع فعال وأن ظروف التحويل مناسبة. حلل التفاعل على هلام الأغاروز. سيُظهر تفاعل التجميع الفعال نواتج مُجمّعة بالحجم الصحيح واختفاء الشظايا. تحقق من تصميم البادئات لشظايا الحمض النووي المتداخلة للتأكد من وجود تداخل كافٍ لتسهيل التجميع. ضع في اعتبارك ما إذا كان الجزء المُستنسخ سامًا لبكتيريا الإشريكية القولونية، وفي هذه الحالة، يُنصح باستخدام ناقل منخفض النسخ، مثل ناقل BAC. نظرًا لأن الناتج المُجمّع جزيء مغلق تساهميًا، يُمكن تضخيمه بديلًا باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) أو تضخيم الدائرة المتدحرجة (RCA). تُشير اختباراتنا إلى أن اختيار الخلايا المؤهلة أمر بالغ الأهمية. نوصي باستخدام خلايا مؤهلة كيميائيًا عالية الكفاءة، مثل خلايا NEB 5-alpha Competent E. coli (عالية الكفاءة) (NEB #C2987). يُمكن إضافة التفاعل مباشرةً إلى الخلايا دون أي تخفيف، على الرغم من أن تخفيف مزيج التفاعل قد يُحسّن كفاءة التحويل. مع ذلك، عند استخدام خلايا مؤهلة كيميائيًا عالية الكفاءة من موردين آخرين، إذا لم تحصل على أي مستعمرات، نوصي بتخفيف التفاعل بنسبة 1:4 قبل التحويل. لتحويل جميع الخلايا المؤهلة كهربائيًا عالية الكفاءة، بما في ذلك خلايا NEB، نوصي بتخفيف التفاعل بنسبة 1:3. س: كيف يمكنني تقليل عدد مستعمرات الخلفية الناتجة عن الناقل فقط؟ ج: لتقليل مستعمرات الخلفية غير المرغوب فيها الناتجة عن الناقل فقط بشكل ملحوظ، يجب أن يكون الناقل ناتج تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) وليس قطعة تقييد. إذا استمرت مشكلة الخلفية، يمكن معالجة الناقل المُضخّم بواسطة PCR باستخدام إنزيم DpnI لإزالة بقايا القالب، إن وجدت، المستخرجة من هلام الأغاروز بعد الفصل الكهربائي. س: ما نوع الخلايا المؤهلة المناسبة لتحويل تركيبات الحمض النووي المُنشأة باستخدام تقنية جيبسون للتجميع؟ ج: تركيبات الحمض النووي الناتجة متوافقة مع معظم خلايا الإشريكية القولونية المؤهلة. توصي NEB باستخدام خلايا NEB 5-alpha المؤهلة من الإشريكية القولونية (عالية الكفاءة، NEB #C2987). إذا كان حجم المنتجات المُجمَّعة أكبر من 10 كيلوبايت، توصي شركة NEB باستخدام بكتيريا الإشريكية القولونية NEB 10-beta المُؤهَّلة (عالية الكفاءة، NEB #C3019) أو بكتيريا الإشريكية القولونية NEB 10-beta المُؤهَّلة للتحويل الكهربائي (NEB #C3020). أما إذا احتوت الجينات المُجمَّعة على تسلسلات متكررة، فيجب استخدام بكتيريا الإشريكية القولونية NEB المُؤهَّلة والمستقرة (NEB #C3040). س: هل يُمكنني استخدام التحويل الكهربائي بدلًا من التحويل الكيميائي؟ ج: نعم، ولكن من الضروري تخفيف ناتج تفاعل تجميع جيبسون ثلاث مرات، واستخدام 1 ميكرولتر فقط للتحويل الكهربائي. ملاحظة: الخلايا المُرفقة مع هذه المجموعة مُؤهَّلة كيميائيًا. س: هل هناك أي اختلافات بين مزيج جيبسون الرئيسي (NEB #E2611) ومزيج جيبسون الرئيسي المُضمَّن في مجموعة استنساخ جيبسون (NEB #E5510)؟ ج: لا، المزيج الرئيسي هو نفسه في كلتا المجموعتين. تتضمن مجموعة استنساخ جيبسون (NEB #E5510) بكتيريا الإشريكية القولونية NEB 5-alpha المؤهلة كيميائيًا. س: هل هناك أي اختلافات بين متطلبات تجميع 2-3 قطع مقابل 4-6 قطع؟ ج: الاختلافات الرئيسية بينهما هي طول التسلسلات المتداخلة بين القطع المتجاورة ووقت حضانة تفاعل التجميع. يُوصى ببروتوكول تفاعل التجميع لمدة 15 دقيقة لتجميع 2-3 قطع محاطة بتداخلات 15-25 نيوكليوتيد. يُوصى ببروتوكول التجميع لمدة ساعة واحدة لتجميع ما يصل إلى 6 قطع، محاطة بتداخلات 20-80 نيوكليوتيد. كما أن إجمالي كمية الحمض النووي في تجميع 4-6 قطع أعلى من تجميع 2-3 قطع. س: لا يُعطيني تفاعل التحكم في مزيج جيبسون الرئيسي أي مستعمرات. لماذا؟ ج: تشير اختباراتنا إلى أن اختيار الخلايا المؤهلة أمر بالغ الأهمية. نوصي باستخدام خلايا كيميائية عالية الكفاءة، مثل خلايا NEB 5-alpha Competent E. coli (عالية الكفاءة) (NEB #C2987). يمكن إضافة التفاعل مباشرةً إلى الخلايا دون تخفيف، مع العلم أن تخفيف مزيج التفاعل قد يُحسّن كفاءة التحويل. أما عند استخدام خلايا كيميائية عالية الكفاءة من موردين آخرين، فإذا لم تتكون أي مستعمرات، نوصي بتخفيف التفاعل بنسبة 1:4 قبل التحويل. وللتحويل إلى جميع الخلايا الكهربائية عالية الكفاءة، بما في ذلك خلايا NEB، نوصي بتخفيف التفاعل بنسبة 1:3. سؤال: عند استخدام بوليميراز لا يحتوي على نشاط إكسونوكلياز 3'-5' (مثل بوليميراز Taq DNA) لتضخيم أجزاء تُستخدم في تفاعل تجميع جيبسون، هل يجب أن أقلق بشأن عدم التطابق المحتمل في الطرف 3' الناتج عن إضافة نيوكليوتيد غير مُستنسخ؟ ج: قد يؤثر هذا النوع من عدم تطابق الطرف 3' على كفاءة التجميع، خاصةً عند محاولة تجميع عدد كبير من القطع (4-6). في هذه الحالات، قد يكون من الضروري فحص المزيد من المستعمرات للحصول على النسخة المُجمَّعة بشكل صحيح. ولمنع ذلك، نوصي باستخدام بوليميرازات تُنتج مُضخَّمات ذات نهايات غير لاصقة، مثل بوليميراز الحمض النووي عالي الدقة Q5. س: هل تخزين مزيج جيبسون الرئيسي للتجميع عند -80 درجة مئوية ضار؟ ج: توصي NEB بتخزين مزيج جيبسون الرئيسي للتجميع عند -20 درجة مئوية، ومع ذلك، فإن المزيج الرئيسي مستقر عند -80 درجة مئوية. عند استخدام المزيج الرئيسي لأول مرة، يُرجى نقله إلى -20 درجة مئوية للتخزين المستقبلي. س: أود استخدام NEBuilder ولكني قلق بشأن خصوصية بيانات المستخدم. كيف تتعامل NEB مع المعلومات التي أدخلها في NEBuilder؟ ج: NEBuilder حساس لخصوصية بيانات المستخدم. في هذه المرحلة، لا تغادر تسلسلات المستخدم متصفح العميل. تتم جميع عمليات المعالجة داخل متصفح المستخدم. يتم الاتصال بخوادم NEB من أجل: 1. تنزيل الصفحة والتعليمات البرمجية المطلوبة إلى المتصفح. 2. استرجاع ملفات المساعدة والأدلة والصور. 3. استرجاع عينة من متجه التسلسل و\/أو تسلسل الإدخال. لا يتم نقل أي بيانات للمستخدم من المتصفح عبر جدار الحماية الخاص بك إلى خوادم NEB. يمكنك التأكد من ذلك بفصل اتصالك بالإنترنت عن المتصفح بعد تحميل الصفحة. مع أنك لن تتمكن من الحصول على تسلسلات متجه التسلسل، إلا أن باقي وظائف التطبيق ستعمل بشكل سليم وستنتج البادئات المطلوبة. برنامج NEBuilder غير مفتوح المصدر حاليًا، كما أنه غير متوفر بنسخة سطح مكتب مستقلة. سؤال: هل يمكنني استخدام أدوات تصميم بادئات أخرى، مثل SnapGene لتجميع Gibson، لتصميم بادئات لتجميع الحمض النووي HiFi باستخدام NEBuilder؟ جواب: قواعد تصميم البادئات متشابهة لكل من تجميع Gibson وتجميع الحمض النووي HiFi باستخدام NEBuilder. أي بادئ مصمم لتجميع Gibson سيعمل مع NEBuilder HiFi. مع ذلك، قد لا تعمل بعض البادئات المتوافقة مع NEBuilder HiFi مع Gibson، لأن NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix، على عكس Gibson Assembly Master Mix، قادر على إزالة عدم تطابق النهاية 3'. قد لا تسمح الأدوات المصممة لبادئات \"Gibson\" بتصميم بادئات تستفيد من هذه الخاصية في NEBuilder HiFi. على الرغم من إمكانية استخدام أدوات أخرى، توصي NEB باستخدام أداتنا المجانية، NEBuilder Assembly Tool، لأنها قادرة على تصميم بادئات تأخذ في الاعتبار نهايات الناقل الناتجة عن هضم إنزيم التقييد. س: ما نوع مقاومة المضادات الحيوية المشفرة في عنصر التحكم الإيجابي NEBuilder (عنصر التحكم في التجميع)؟ ج: عنصر التحكم الإيجابي NEBuilder عبارة عن إدخال واحد في بلازميد pUC19 مقاوم للأمبيسيلين. إذا كان مزيج التجميع الخاص بك يعمل بشكل صحيح، فستحصل على مستعمرات على طبق أمبيسيلين باستخدام عنصر التحكم الإيجابي NEBuilder.","brand":"New England Biolabs","offers":[{"title":"Default Title","offer_id":46835524665513,"sku":"E2611S","price":0.99,"currency_code":"USD","in_stock":true}],"url":"https:\/\/iright.com\/ar\/products\/neb-e2611s","provider":"Iright","version":"1.0","type":"link"}