{"product_id":"neb-e7120s","title":"مجموعة نيو إنجلاند بيولابس E7120S، NEBNext® لتسلسل الميثيل الإنزيمي","description":"لم تعد هذه المجموعة مزودة ببادئات التسلسل. توصي NEB باستخدام \u003cb\u003eالفئات ذات الصلة:\u003c\/b\u003e التحويل الإنزيمي لتحليل مثيلة الحمض النووي، والأتمتة لتحضير مكتبة NEBNext® NGS، وتحليل الميثيلوم. \u003cb\u003eالمواد المطلوبة (غير المرفقة\u003c\/b\u003e \u003cb\u003e)\u003c\/b\u003e : جهاز Covaris® S2 أو أي جهاز تجزئة آخر، أنابيب شرائح PCR، فورماميد (Sigma #F9037-100 مل) أو هيدروكسيد الصوديوم 0.1 N، إيثانول 80%، محلول TE 0.1X، درجة حموضة 8.0، ماء خالٍ من النيوكلياز، حامل مغناطيسي (مثل حامل الفصل المغناطيسي NEBNext (NEB #S1515))، جهاز PCR، Bioanalyzer®، TapeStation® والمواد الاستهلاكية المرتبطة بها أو أي محلل شظايا آخر. \u003cb\u003eالأسئلة الشائعة\u003c\/b\u003e : س: ما أنواع العينات التي يمكن معالجتها باستخدام مجموعة NEBNext® Enzymatic Methyl-seq ووحدة التحويل الإنزيمي لـ Enzymatic Methyl-seq؟ ج: يمكن استخدام تقنية NEBNext Enzymatic Methyl-seq مع الحمض النووي الجينومي، والحمض النووي الخالي من الخلايا، والحمض النووي المُستخلص من الأنسجة المُثبتة بالفورمالين والمُضمنة في البارافين (FFPE). س: ما هي المدخلات الموصى بها لمجموعة NEBNext® Enzymatic Methyl-seq ووحدة تحويل Enzymatic Methyl-seq؟ ج: تم تحسين البروتوكول للمدخلات التي تتراوح بين 10 و200 نانوغرام. كما يتوفر بروتوكول مُعدل للمدخلات التي تصل إلى 500 نانوغرام. س: ما الفرق بين مجموعة NEBNext Enzymatic Methyl-seq ووحدة تحويل Enzymatic Methyl-seq؟ ج: تحتوي مجموعة NEBNext Enzymatic Methyl-seq على جميع المكونات اللازمة لإنشاء مكتبة EM-seq، بما في ذلك الكواشف اللازمة لأكسدة 5-mC\/5-hmC وإزالة أمين السيتوزين، وكواشف بناء المكتبة، ومحول EM-seq، بالإضافة إلى مزيج NEBNext Q5U الرئيسي وبادئين فريدين لتضخيم المكتبة. لا تحتوي وحدة تحويل Enzymatic Methyl-seq على كواشف لبناء المكتبة وتضخيمها، أو محولات وبادئات. س: ما هي المحاليل المنظمة الموصى بها لتقطيع الحمض النووي في سير عمل NEBNext® Enzymatic Methyl-seq (EM-seq™)؟ ج: لاستخدام مجموعات NEBNext® Enzymatic Methyl-seq (NEB #E7120، #E8015)، يجب تقطيع الحمض النووي في أحد المحاليل المنظمة التالية: 10 ملي مولار Tris-HCl بدرجة حموضة 7.5 أو 8.0، أو 1X TE (10 ملي مولار Tris-HCl بدرجة حموضة 8.0، 1 ملي مولار EDTA)، أو محلول TE منخفض التركيز (10 ملي مولار Tris-HCl بدرجة حموضة 8.0، 0.1 ملي مولار EDTA). لا نوصي بتقطيع الحمض النووي المدخل في محلول 0.1X TE (1 ملي مولار Tris-HCl، 0.1 ملي مولار EDTA) أو الماء. عند استخدام وحدات تحويل NEBNext Enzymatic Methyl-seq (NEB #E7125، #E8020)، يجب ألا يكون الحمض النووي في محلول منظم يحتوي على EDTA قبل البدء بتفاعل الأكسدة. لذا، يُوصى بتقطيع الحمض النووي في محلول Tris بتركيز 10 ملي مولار ودرجة حموضة 8.0. بدلاً من ذلك، في حال التقطيع في محلول TE بتركيز 1X أو تركيز منخفض من TE، يلزم تنظيف العمود أو الخرز، ثم الإذابة في محلول Tris-HCl بتركيز 10 ملي مولار ودرجة حموضة 8.0 أو في ماء خالٍ من النيوكلياز. س: ما هو تركيز مُهايئ EM-seq وبادئات فهرسة EM-seq؟ ج: تركيز مُهايئ EM-seq هو 15 ميكرومولار، وتركيز بادئات فهرسة EM-seq هو 10 ميكرومولار. س: هل يُمكن تخزين محلول TET2 النشط لأكثر من 4 أشهر؟ ج: لا. يجب التخلص من محلول TET2 النشط بعد 4 أشهر. س: لماذا تتصرف خرزات تنقية العينات NEBNext بشكل مختلف عند تنظيف العينة في بعض مراحل بروتوكول EM-seq؟ ج: يتغير سلوك الخرز تبعًا لعملية التنظيف وخطوة تفاعل EM-seq السابقة. يجب توخي الحذر بعد إزالة الأمين بواسطة APOBEC لأن الخرز يميل إلى التكتل بسهولة أكبر. تجنب تجفيف الخرز بشكل مفرط قبل استخلاص الحمض النووي في هذه الخطوة، فقد يؤدي ذلك إلى صعوبة إعادة تعليق الخرز، وربما انخفاض كمية الحمض النووي المستخلص منه. س: ما هو الحجم المتوقع لمكتبة EM-seq؟ ج: يبلغ حجم مكتبات EM-seq القياسية حوالي 370-420 زوجًا قاعديًا. يمكن الحصول على إدخالات أكبر بحجم 470-520 زوجًا قاعديًا باستخدام البروتوكول المعدل المذكور في الدليل. س: كيف يتم تسلسل مكتبات EM-seq؟ ج: بالنسبة لتسلسل Illumina، يتحدد طول القراءة في النهاية بحجم المكتبة. يمكن تسلسل المكتبات ذات الحجم القياسي باستخدام قراءتين بطول 76 قاعدة أو قراءتين بطول 100 قاعدة. يمكن استخدام قراءتين بطول 150 قاعدة للمكتبات ذات الإدخالات الأطول. س: كيف يتم تحليل بيانات تسلسل EM-seq™؟ ج: تُعطي مكتبات EM-seq المُسلسلة نفس مخرجات مكتبات البيسلفيت، حيث يُسلسل السيتوزين على أنه ثايمين، ويُسلسل 5mC أو 5hmC على أنه سيتوزين. يمكن استخدام مسارات العمل المُعتمدة لتحليل بيانات البيسلفيت. لدينا أيضًا مسار عمل تجريبي وبيانات نموذجية على مكتبة GitHub: https:\/\/github.com\/nebiolabs\/EM-seq\/ س: هل يمكن استبدال مُهايئ EM-seq بمُهايئ آخر؟ ج: لا يُنصح بذلك. تم تحسين مُهايئ EM-seq للاستخدام مع مجموعة NEBNext Enzymatic Methyl-seq، ومن المُرجح أن يؤدي استبداله بمُهايئ آخر إلى انخفاض الأداء. س: هل مكتبات EM-seq اتجاهية أم غير اتجاهية؟ ج: مكتبات EM-seq اتجاهية. س: هل يمكن استخدام محاليل تخزين أخرى بدلاً من محلول الإذابة المُرفق لـ EM-seq؟ ج: يجب استخدام محلول الإذابة EM-seq حيثما هو مذكور في البروتوكول، باستثناء حالة التخزين طويل الأمد لمكتبات EM-seq المُضخّمة بتقنية PCR، حيث تتوفر خيارات أخرى (محددة في الدليل). س: كيف يتم تحضير المكتبات من الحمض النووي الخالي من الخلايا (cfDNA) باستخدام مجموعة NEBNext® EM-seq (NEB #E7120)؟ ج: مع الحمض النووي الخالي من الخلايا، لا حاجة لتقطيع الحمض النووي قبل تحضير المكتبة. يمكن نقل 10-200 نانوغرام من الحمض النووي الخالي من الخلايا مباشرةً إلى جهاز NEBNext Ultra II لتحضير مكتبة الحمض النووي، ثم تُتبع خطوات التحويل الأنزيمي EM-seq وتضخيم المكتبة كما هو موضح في دليل المنتج. س: هل يمكن تحضير المكتبات من الحمض النووي المُثبّت بالفورمالين والمُضمّن في البارافين (FFPE) باستخدام مجموعة NEBNext® EM-seq (NEB #E7120)؟ ج: نعم، يمكن تحضير المكتبات باستخدام 10-200 نانوغرام من الحمض النووي المُثبّت بالفورمالين والمُضمّن في البارافين. يجب تقطيع الحمض النووي وبناء المكتبات وفقًا لدليل EM-seq. قد يلزم تحسين دورات تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)، ولكننا نوصي بزيادة عدد الدورات بمقدار دورتين على الأقل لكميتي 10 نانوغرام و50 نانوغرام (أي، استخدم 10 دورات PCR على الأقل لكمية 10 نانوغرام، و8 دورات PCR على الأقل لكمية 50 نانوغرام). تجدر الإشارة إلى أن المكتبات المُحضّرة من الحمض النووي المُثبّت بالفورمالين والمُضمّن في البارافين (FFPE) قد تحتوي على مستويات أعلى من مثيلة الحمض النووي في سياقي CHH وCHG. مع ذلك، فإن استخدام مُرشّح 3xC (المتوفر في برنامج Bismark) أو ما شابهه، يُقلّل من هذه المستويات. يُزيل هذا المُرشّح القراءات التي تحتوي على 3 قواعد سيتوزين (C) متتالية أو أكثر غير مُحوّلة في سياق غير CpG (أي CHG\/CHH). س: ما هي مستويات التحويل النموذجية مع الحمض النووي المُتحكّم به المُرفق في مجموعة EM-seq؟ ج: تُوفّر مجموعة EM-seq نوعين من الحمض النووي المُتحكّم به: حمض نووي لامدا غير مثيل، وحمض نووي pUC19 مثيل بمواقع CpG. عادةً ما يتم الكشف عن نسبة مثيلة تصل إلى 0.5% في لامدا غير المثيلة، مما يشير إلى كفاءة تحويل تبلغ 99.5%. وهذا مشابه لكفاءة التحويل الملاحظة مع تقنية WGBS. بالنسبة لـ pUC19 المثيل بـ CpG، يتم الكشف عن مثيلة CpG بنسبة 96-98% لكل من سير عمل EM-seq وتقنية WGBS. بما أن حمض pUC19 النووي مثيل إنزيميًا، فمن المحتمل عدم الوصول إلى نسبة مثيلة 100%، وأن بعض مواقع CpG غير مثيلة. س: هل تتوفر أوراق عينات للاستخدام مع NEBNext® Multiplex Oligos لتقنية EM-seq؟ ج: يمكن العثور على أوراق العينات في قسم إرشادات الاستخدام في صفحة المنتج. س: هل يمكن استخدام الحمض النووي المجزأ إنزيميًا كمادة إدخال لتقنية EM-seq™؟ ج: NEBNext UltraShear™ هو كاشف التجزئة الإنزيمية الوحيد الذي نوصي به قبل سير عمل EM-Seq. لا نوصي باستخدام طرق التجزئة الأخرى القائمة على الإنزيمات لأنها قد تؤثر على علامات مثيلة الحمض النووي. لاستخدام تقنية EM-seq™ مع جهاز NEBNext UltraShear™، يُرجى اتباع البروتوكول الوارد في \"القسم 3\" من الدليل المرفق أدناه. https:\/\/www.neb.com\/-\/media\/nebus\/files\/manuals\/manualm7634.pdf?rev=64e0e81d781748dba43702e4a78da971\u0026amp;hash=09F5E6499849C9045DFAE1A3AB3BDAA9 سؤال: كيف ينبغي تخفيف عينات التحكم للتطبيقات التي تتضمن التسلسل السطحي؟ ج: بالنسبة للتطبيقات التي يتم فيها التسلسل بعمق أقل من 10 ملايين قراءة مزدوجة، نوصي بتخفيفات التحكم التالية بناءً على كمية عينة الإدخال: 200 نانوغرام: بدون تخفيف لعينات الحمض النووي الضابطة، 10 نانوغرام: تخفيف 1:10 لعينات الحمض النووي الضابطة، 1 نانوغرام: تخفيف 1:25 لعينات الحمض النووي الضابطة، 0.1 نانوغرام: تخفيف 1:25 لعينات الحمض النووي الضابطة. نوصي بوجود 5000 قراءة على الأقل تُطابق جينوم لامدا غير المُمَثْيَل و500 قراءة تُطابق جينوم pUC19 المُمَثْيَل CpG بطول قراءة 76 قاعدة للحصول على تغطية كافية لتحديد كفاءة التحويل بثقة. س: هل يمكنني استخدام هيدروكسيد الصوديوم (NaOH) بدلاً من الفورماميد لفصل سلسلتي الحمض النووي قبل تفاعل إزالة الأمين؟ ج: هل يمكنني استخدام هيدروكسيد الصوديوم (NaOH) بدلاً من الفورماميد لفصل سلسلتي الحمض النووي قبل تفاعل إزالة الأمين؟ نعم، من الممكن استخدام هيدروكسيد الصوديوم (NaOH)، مع أن الفورماميد يُوصى به لسهولة التعامل معه. عند استخدام هيدروكسيد الصوديوم، يجب أن يكون تركيز محلوله دقيقًا، وأن يكون حجمه المُضاف إلى التفاعل 4 ميكرولتر بالضبط. هيدروكسيد الصوديوم مادة شديدة التآكل، لذا يجب اتباع إرشادات السلامة المحلية والمؤسسية عند التعامل معه. عند تحضير محلول مخفف من هيدروكسيد الصوديوم بتركيز 2 مولار، تأكد من أن الرقم الهيدروجيني للمحلول الأصلي لا يقل عن 12.5. تحقق من الرقم الهيدروجيني للمحلول الأصلي قبل الاستخدام. تجنب التخفيفات غير الدقيقة بتحضير حجم كافٍ من هيدروكسيد الصوديوم المخفف لتقليل أخطاء السحب بالماصة. نوصي بتحضير 1 مل على الأقل. حضّر محاليل هيدروكسيد الصوديوم المخففة طازجة أو خزّن أجزاءً مخففة منها في درجة حرارة -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر لتجنب تغير التركيز. هيدروكسيد الصوديوم الصلب مادة متميعة (تمتص الرطوبة من الجو)، ولا يمكن وزنها بدقة. لذلك، يجب معايرة المحاليل المُحضّرة من حبيبات هيدروكسيد الصوديوم للوصول إلى التركيز المطلوب. س: هل المكتبات ذات الفهرسة المزدوجة متوافقة مع تسلسل القراءة المفردة؟ ج: نعم، تتوافق بادئات NEBNext Oligos الخاصة بـ Illumina، بما في ذلك بادئات الفهرسة المزدوجة، مع تسلسل القراءة المفردة. يُرجى الرجوع إلى دليل نظرة عامة على التسلسل المفهرس من Illumina (الإصدار الحالي) للاطلاع على تفاصيل سير عمل التسلسل ذي الفهرسة المزدوجة على خلية تدفق القراءة المفردة أو خلية تدفق القراءة المزدوجة. س: هل من الطبيعي أن يكون محلول Fe(II) من منتج EM-seq™ أصفر اللون أو أن يُلاحظ تغير في اللون؟ ج: نعم، لوحظ تغير في اللون (من عديم اللون إلى أصفر). أظهرت الاختبارات عدم وجود فرق في الأداء بناءً على هذا التغير. س: ما النسبة المئوية لـ PhiX المطلوبة لمكتبات EM-seq™؟ ج: راجع توصيات Illumina®. لقد حققنا نجاحًا باستخدام النسب المئوية التالية من PhiX: NovaSeq®: 5% PhiX، NextSeq® 2000: 5% PhiX، NextSeq 500\/550: 35% PhiX، MiSeq®: 5% PhiX. س: هل يمكن تخزين محلول الحديد الثنائي المخفف حديثًا لفترة طويلة؟ ج: لا. يجب التخلص من محلول الحديد المخفف حديثًا فور استخدامه. س: هل تتضمن المجموعة بادئات؟ ج: لا. يمكن استخدام المجموعة مع بادئات NEBNext LV الفريدة ذات الفهرس المزدوج. للاطلاع على قائمة كاملة ببادئات الفهرس المزدوج الفريدة منخفضة الحجم (LV)، يُرجى مراجعة العمود الثالث من مخطط اختيار قليل النوكليوتيدات المتعددة NEBNext®. للاستخدام مع مجموعات تحضير مكتبات NEBNext، يُرجى الرجوع إلى دليل مجموعة تحضير المكتبات. تحتوي أدلة بادئات NEBNext LV الفريدة ذات الفهرس المزدوج أيضًا على نصائح لإعداد تفاعلات الربط. لخيارات موازنة الألوان، يُرجى مراجعة مُحدد NEBNext® Index Oligo Selector للاطلاع على تركيبات الباركود الصالحة. س: هل المكتبات ذات الفهرسة المزدوجة متوافقة مع تسلسل القراءة المفردة؟ ج: نعم، تتوافق NEBNext Oligos for Illumina، بما في ذلك الأوليغومرات ذات الفهرسة المزدوجة، مع تسلسل القراءة المفردة. يُرجى الرجوع إلى دليل نظرة عامة على التسلسل المفهرس من Illumina (الإصدار الحالي) للاطلاع على تفاصيل سير عمل التسلسل ذي الفهرسة المزدوجة على خلية تدفق القراءة المفردة أو خلية تدفق القراءة المزدوجة. س: هل من الطبيعي أن يكون محلول Fe(II) من منتج EM-seq أصفر اللون أو أن يُلاحظ تغير في اللون؟ ج: نعم، لوحظ تغير في اللون (من عديم اللون إلى أصفر). أظهرت الاختبارات عدم وجود فرق في الأداء بناءً على هذا التغير. س: هل مكتبات EM-seq اتجاهية أم غير اتجاهية؟ ج: مكتبات EM-seq اتجاهية. س: هل يمكن استبدال محول EM-seq بمحول آخر؟ ج: لا يُنصح بذلك. تم تحسين محول EM-seq للاستخدام مع مجموعة NEBNext Enzymatic Methyl-seq، ومن المرجح أن يؤدي استبداله بمحول آخر إلى انخفاض الأداء. س: هل يمكنني استخدام هيدروكسيد الصوديوم (NaOH) بدلاً من الفورماميد لفصل سلسلتي الحمض النووي قبل تفاعل إزالة الأمين؟ ج: نعم، من الممكن استخدام هيدروكسيد الصوديوم، على الرغم من أن الفورماميد يُوصى به لسهولة التعامل معه. عند استخدام هيدروكسيد الصوديوم، من الضروري أن يكون تركيز محلول هيدروكسيد الصوديوم دقيقًا وأن يكون الحجم المضاف إلى التفاعل 4 ميكرولتر بالضبط. هيدروكسيد الصوديوم مادة أكالة للغاية. يجب اتباع إرشادات السلامة المحلية والمؤسسية عند التعامل معه. إذا كنت تُحضّر محلولًا مخففًا من هيدروكسيد الصوديوم بتركيز 2 مولار، فتأكد من أن الرقم الهيدروجيني للمحلول الأصلي لا يقل عن 12.5. تحقق من الرقم الهيدروجيني للمحلول الأصلي قبل الاستخدام. تجنب التخفيفات غير الدقيقة بتحضير حجم كافٍ من هيدروكسيد الصوديوم المخفف لتقليل أخطاء السحب بالماصة. نوصي بتحضير 1 مل على الأقل. حضّر محاليل هيدروكسيد الصوديوم المخففة طازجة أو خزّن أجزاءً مخففة منها عند درجة حرارة -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر لتجنب تغير التركيز. هيدروكسيد الصوديوم الصلب مادة متميعة (تمتص الرطوبة من الجو)، ولا يمكن وزنها بدقة. لذلك، يجب معايرة المحاليل المحضرة من حبيبات هيدروكسيد الصوديوم للوصول إلى التركيز المناسب. س: هل يمكن تخزين محلول TET2 النشط لأكثر من 4 أشهر؟ ج: لا، يجب التخلص من محلول TET2 النشط بعد 4 أشهر. س: ما هي المحاليل المنظمة الموصى بها لتقطيع الحمض النووي في سير عمل تسلسل الميثيل الإنزيمي (EM-seq™) من شركة NEB؟ ج: لاستخدام مجموعة NEBNext® Enzymatic Methyl-seq Kit (NEB #E7120)، يجب تقطيع الحمض النووي في أحد المحاليل المنظمة التالية: 10 ملي مولار Tris-HCl بدرجة حموضة 7.5 أو 8.0، أو 1X TE (10 ملي مولار Tris-HCl بدرجة حموضة 8.0، 1 ملي مولار EDTA)، أو محلول TE منخفض التركيز (10 ملي مولار Tris-HCl بدرجة حموضة 8.0، 0.1 ملي مولار EDTA). لا نوصي بتقطيع الحمض النووي المدخل في محلول TE بتركيز 0.1X (1 ملي مولار Tris-HCl، 0.1 ملي مولار EDTA) أو الماء. لاستخدام وحدة تحويل NEBNext® Enzymatic Methyl-seq Conversion Module (NEB #E7125)، يجب ألا يكون الحمض النووي في محلول منظم يحتوي على EDTA قبل البدء بتفاعل الأكسدة. لذا، يُوصى بتقطيع الحمض النووي في محلول Tris بتركيز 10 ملي مولار ودرجة حموضة 8.0. بدلاً من ذلك، في حال التقطيع في محلول TE بتركيز 1X أو تركيز منخفض، يلزم تنظيف العمود أو الخرز، ثم الإذابة في محلول Tris-HCl بتركيز 10 ملي مولار ودرجة حموضة 8.0 أو في ماء خالٍ من النيوكلياز. س: كيف تُحلل بيانات تسلسل EM-seq™؟ ج: تُعطي مكتبات EM-seq المُسلسلة نفس مخرجات مكتبات البيسلفيت، حيث يُسلسل السيتوزين على أنه ثايمين، ويُسلسل 5mC أو 5hmC على أنه سيتوزين. يمكن استخدام مسارات تحليل بيانات البيسلفيت المُعتمدة. كما يتوفر لدينا مسار تجريبي وبيانات نموذجية على مكتبة GitHub: https:\/\/github.com\/nebiolabs\/EM-seq\/","brand":"New England Biolabs","offers":[{"title":"Default Title","offer_id":46835514343593,"sku":"E7120S","price":0.99,"currency_code":"USD","in_stock":true}],"url":"https:\/\/iright.com\/ar\/products\/neb-e7120s","provider":"Iright","version":"1.0","type":"link"}