{"product_id":"neb-m0648s","title":"مختبرات نيو إنجلاند البيولوجية، M0648S، APOBEC3A","description":"\u003cb\u003eالفئات ذات الصلة:\u003c\/b\u003e إنزيمات تعديل القواعد، تحليل مثيلة الحمض النووي، إنزيمات تعديل الحمض النووي وتقنيات الاستنساخ. \u003cb\u003eالمواد المطلوبة ولكن غير المرفقة: حمض\u003c\/b\u003e \u003cb\u003eنووي\u003c\/b\u003e أحادي السلسلة يحتوي على dC أو 5mC، فورماميد (لتمسخ الحمض النووي ثنائي السلسلة إذا لزم الأمر)، أنابيب طرد مركزي دقيقة، جهاز تدوير حراري أو كتلة تسخين \u003cb\u003e. تعريف الوحدة:\u003c\/b\u003e تُعرَّف الوحدة الواحدة بأنها كمية الإنزيم المطلوبة لإزالة الأمين من 5 بيكومول من قليل النوكليوتيدات المكون من 44 قاعدة والموسوم بصبغة فلورية والذي يحتوي على قاعدة سيتوزين واحدة في 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية في حجم تفاعل إجمالي قدره 20 ميكرولتر في محلول منظم لتفاعل إزالة الأمين 1X. درجة حرارة التخزين -20 درجة مئوية. \u003cb\u003eشروط التفاعل:\u003c\/b\u003e محلول تفاعل إزالة الأمين 1X، حضانة عند 37 درجة مئوية. \u003cb\u003eالتثبيط الحراري:\u003c\/b\u003e 70 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. \u003cb\u003eشروط فحص الوحدة:\u003c\/b\u003e يتم حضانة 5 بيكومول من أوليغونوكليوتيد مكون من 44 قاعدة موسوم بصبغة فلورية، يحتوي على سيتوزين واحد، مع وحدة واحدة من APOBEC3A لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية في حجم تفاعل إجمالي قدره 20 ميكرولتر في محلول تفاعل إزالة الأمين 1X. ثم يتم حضانة الحمض النووي أحادي السلسلة المحتوي على اليوراسيل الناتج عن الإنزيم مع إنزيم USER في محلول rCutSmart 1X لقطع العمود الفقري الفوسفودايستر عند موقع اليوراسيل. يتم قياس الناتج بواسطة الفصل الكهربائي الشعيري لتحديد نشاط إزالة الأمين لـ APOBEC3A. \u003cb\u003eالأسئلة الشائعة\u003c\/b\u003e : س: ما هو نشاط APOBEC3A (NEB #M0648) في محاليل NEBuffers المختلفة؟ ج: بالمقارنة مع نشاطه الأمثل في محلول تفاعل نزع الأمين، يتمتع APOBEC3A بنشاط في محاليل التفاعل التالية: NEBuffer r1.1 25%، NEBuffer r2.1 \u0026lt;10%، NEBuffer r3.1 0%، rCutSmart™ Buffer \u0026lt;10%. س: هل يمكن تعطيل APOBEC3A (NEB #M0648) بالحرارة؟ ج: نعم، يمكن تعطيل APOBEC3A عند 70 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. كما يمكن إزالة APOBEC3A بمعالجته ببروتياز K غير المستقر حراريًا (NEB #P8111). س: ما هو الوزن الجزيئي لـ APOBEC3A (NEB #M0648)؟ ج: الوزن الجزيئي لـ APOBEC3A هو 23856 دالتون. س: هل APOBEC3A (NEB #M0648) بروتين موسوم؟ ج: يحتوي APOBEC3A على علامة هيستيدين في الطرف الكربوكسيلي. س: ما هو النشاط النسبي لـ APOBEC3A (NEB #M0648) على ركائز الحمض النووي أحادي السلسلة المعدلة المختلفة المحتوية على dC؟ ج: على الرغم من أن APOBEC3A يفضل ركائز الحمض النووي أحادي السلسلة المحتوية على C، إلا أنه يُزيل مجموعة الأمين من الحمض النووي أحادي السلسلة المحتوي على 5mC بنشاط أقل بمقدار الضعف في تفاعل مدته 30 دقيقة في ظل ظروف التفاعل الموصى بها. في حضانة ليلية (16 ساعة)، يمكن لـ APOBEC3A إزالة مجموعة الأمين بالكامل من الحمض النووي أحادي السلسلة المحتوي على 5mC، ويمكنه إزالة مجموعة الأمين من الحمض النووي أحادي السلسلة المحتوي على 5-هيدروكسي ميثيل سيتوزين (5hmC) بنسبة أقل من 10%. إنزيم APOBEC3A غير نشط على الحمض النووي أحادي السلسلة (ssDNA) الذي يحتوي على بيتا-غلوكوزيل-5-هيدروكسي ميثيل سيتوزين (5gmC)، أو 5-كربوكسي سيتوزين (5caC)، أو 5-فورميل سيتوزين (5fC). نشاط تعديل الحمض النووي أحادي السلسلة بعد 30 دقيقة. النشاط بعد 16 ساعة: من C إلى U 100% 100%، من 5mC إلى T 50% 100%، من 5hmC إلى 5hmU 0% \u0026lt;10%، من 5fC إلى 5fU 0% 0%، من 5caC إلى 5caU 0% 0%، من 5gmC إلى 5gmU 0% 0%. تم تحديد النشاط على ركائز الحمض النووي أحادي السلسلة المعدلة C عن طريق حضانة 1 ميكرولتر من APOBEC3A مع 1 ميكروغرام (73 بيكومول) من قليل نيوكليوتيدات DNA مكون من 44 قاعدة يحتوي على C واحد أو C معدل عند 37 درجة مئوية في حجم تفاعل إجمالي قدره 40 ميكرولتر في محلول منظم لتفاعل إزالة الأمين 1X. تم تعطيل العينات بالحرارة عند كل نقطة زمنية ثم تحليلها بواسطة LCMS. س: ما هي تعديلات الحمض النووي التي تحمي السيتوزين من إزالة الأمين بواسطة APOBEC3A (NEB #M0648)؟ ج: تُقاوم مركبات 5-فورميل سيتوزين (5fC) و5-كربوكسي سيتوزين (5caC) وبيتا-غلوكوزيل-5-هيدروكسي ميثيل سيتوزين (5gmC) عملية نزع الأمين بواسطة إنزيم APOBEC3A. س: هل إنزيم APOBEC3A (NEB #M0648) فعال على الحمض النووي المزدوج السلاسل؟ ج: لا يُنصح باستخدام إنزيم APOBEC3A مع ركائز الحمض النووي المزدوج السلاسل. وقد تم تحديد فعاليته على الحمض النووي المزدوج السلاسل بأقل من 10% عن طريق حضانة 1 ميكرولتر من إنزيم APOBEC3A مع 5 بيكومول من الحمض النووي المزدوج السلاسل المكون من 44 قاعدة والذي يحتوي على السيتوزين لمدة 30 دقيقة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية في حجم تفاعل إجمالي قدره 20 ميكرولتر في محلول منظم لتفاعل نزع الأمين بتركيز 1X. بالنسبة لركائز الحمض النووي المزدوج السلسلة (dsDNA)، نوصي بتحويله إلى حمض نووي أحادي السلسلة (ssDNA) قبل إزالة الأمين، وذلك بإضافة الفورماميد إلى الحمض النووي المزدوج السلسلة (في الماء) وحضانته عند 85 درجة مئوية لمدة 10 دقائق، ثم تبريده فورًا على الجليد قبل البدء بتفاعل APOBEC3A. بدلاً من ذلك، يمكن تحويل الحمض النووي المزدوج السلسلة بإضافة 4 ميكرولتر من هيدروكسيد الصوديوم (NaOH) بتركيز 0.05 مولار إلى الحمض النووي المزدوج السلسلة (في الماء) وحضانته عند 85 درجة مئوية لمدة 10 دقائق، ثم تبريده فورًا على الجليد قبل البدء بتفاعل APOBEC3A. سؤال: هل إنزيم APOBEC3A (NEB #M0648) فعال على الحمض النووي الريبوزي (RNA)؟ أ: على الرغم من أن APOBEC3A قد ثبت سابقًا نشاطه على RNA1,2، إلا أننا لم نلاحظ أي نشاط لـ APOBEC3A على ركيزة RNA في ظل ظروف الاختبار (تم تحضين 1 ميكروغرام (156 بيكومول) من RNA مكون من 20 قاعدة يحتوي على السيتوزين مع 16 وحدة من APOBEC3A لمدة ساعتين عند 37 درجة مئوية في محلول تفاعل إزالة الأمين 1X). لذلك، لا نوصي باستخدام APOBEC3A لإزالة الأمين من ركائز RNA. باركا، أ. وآخرون. إنزيم تحرير القاعدة APOBEC3A يحفز إزالة أمين السيتوزين في RNA بكفاءة منخفضة وانتقائية عالية. (2022) ACS Chem Biol. 17 (3) 629-636. https:\/\/doi.org\/10.1021\/acschembio.1c00919. شارما، س. وآخرون. يحفز إنزيم APOBEC3A، وهو دياميناز السيتيدين، تعديل الحمض النووي الريبوزي (RNA) في الخلايا الوحيدة والخلايا البلعمية. (2015) Nat Commun. 6, 6881. https:\/\/doi.org\/10.1038\/ncomms7881. س: هل يُظهر إنزيم APOBEC3A (NEB #M0648) أي تفضيل تسلسلي؟ ج: نعم، يُفضل إنزيم APOBEC3A التسلسل TC \u0026gt; CC \u0026gt; GC \u0026gt; AC 1, 2, 3، حيث يُمثل C المُسطّر السيتوزين المستهدف لإزالة الأمين في ثنائي النوكليوتيد. ولضمان فعالية قوية على جميع الركائز، استُخدمت الركيزة الأقل تفضيلاً، وهي وحدة AC، لتحديد الوحدة. سيلفاس، تي في، وآخرون. انتقائية تسلسل الركيزة لإنزيم APOBEC3A تُشير إلى تفاعلات داخل الحمض النووي (DNA). (2018) Sci Rep. 8, 7511. https:\/\/doi.org\/10.1038\/s41598-018-25881-z. ستينجلين، م. وآخرون. بروتينات APOBEC3 تتوسط إزالة الحمض النووي الغريب من الخلايا البشرية. (2010) Nat. Struct. Mol. Biol. 14, 222-229. https:\/\/doi.org\/10.1038\/nsmb.1744. فارتانيان، ج. ب. وآخرون. دليل على تعديل الحمض النووي لفيروس الورم الحليمي البشري بواسطة APOBEC3 في الآفات الحميدة وما قبل السرطانية. (2008) Science. 320, (5873) 230-233. https:\/\/doi.org\/10.1126\/science.1153201. س: ما هي درجات الحرارة التي يكون فيها APOBEC3A (NEB #M0648) نشطًا؟ ج: يكون APOBEC3A نشطًا في نطاق درجة حرارة يتراوح بين 25 و50 درجة مئوية، ولكن يوصى باستخدامه لنشاط إزالة الأمين عند 37 درجة مئوية.","brand":"New England Biolabs","offers":[{"title":"Default Title","offer_id":46835492389033,"sku":"M0648S","price":0.99,"currency_code":"USD","in_stock":true}],"url":"https:\/\/iright.com\/ar\/products\/neb-m0648s","provider":"Iright","version":"1.0","type":"link"}