{"product_id":"neb-p0706s","title":"نيو إنجلاند بيولابس، P0706S، ريموف-آي تي® بي إن جي إي إس إف","description":"Remove-iT \u003cb\u003eالفئات ذات الصلة\u003c\/b\u003e : الإندوغليكوزيداز، \u003cb\u003eتطبيقات\u003c\/b\u003e تحليل البروتينات، أنظمة التعبير، تسلسل الغليكان، علم البروتينات، \u003cb\u003eتعريف وحدة\u003c\/b\u003e \u003cb\u003eالمواصفات\u003c\/b\u003e : تُعرف الوحدة الواحدة بأنها كمية الإنزيم المطلوبة لإزالة أكثر من 95٪ من الكربوهيدرات من 5 ميكروغرام من RNase B المنزوع الطبيعة بواسطة DTT في ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية في حجم تفاعل إجمالي قدره 10 ميكرولتر. \u003cb\u003eشروط التفاعل:\u003c\/b\u003e محلول جليكوبازر 2 بتركيز 1X، حضانة عند 37 درجة مئوية. محلول جليكوبازر 2 بتركيز 1X، فوسفات الصوديوم 50 ملي مولار (الأس الهيدروجيني 7.5 عند 25 درجة مئوية). \u003cb\u003eمحلول التخزين:\u003c\/b\u003e 20 ملي مولار Tris-HCl، 50 ملي مولار NaCl، 5 ملي مولار EDTA، الأس الهيدروجيني 7.5 عند 25 درجة مئوية. \u003cb\u003eالتثبيط الحراري\u003c\/b\u003e : 75 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. \u003cb\u003eالوزن الجزيئي\u003c\/b\u003e الظاهري: 41 كيلو دالتون. \u003cb\u003eشروط فحص الوحدة:\u003c\/b\u003e يتم تسخين 5 ميكروغرام من RNase B باستخدام DTT بتركيز 1X عند 55 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. بعد إضافة محلول جليكوبازر 2 بتركيز 1X، يتم إضافة تخفيفات متسلسلة من Remove-iT PNGase F، ويتم حضانة مزيج التفاعل لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية. يتم تصوير فصل نواتج التفاعل باستخدام SDS-PAGE. \u003cb\u003eالأسئلة الشائعة\u003c\/b\u003e : س: ما هي العلامة الموجودة على PNGase F؟ ج: إنزيم PNGase F مُوسَم بنطاق ربط الكيتين (CBD). يسمح وسم CBD بإزالته من التفاعل باستخدام خرز الكيتين (NEB #S6651) أو خرز الكيتين المغناطيسي (NEB #E8036). ملاحظة: لا يوجد موقع انقسام بين إنزيم PNGase F ووسم CBD لتمكين إزالة هذا الوسم من إنزيم PNGase F. س: حاولتُ إزالة الغليكوزيل من بروتيني السكري باستخدام Remove-iT® PNGase F، لكنني لم ألاحظ إزالة الكربوهيدرات. ما المشكلة؟ ج: هل تعرف كيف ترتبط الكربوهيدرات بالبروتين؟ هل هي مرتبطة برابطة N أم O (مرتبطة بالأسباراجين، أو السيرين\/الثريونين)؟ سيزيل Remove-iT® PNGase F الكربوهيدرات المرتبطة بالأسباراجين فقط. أما إنزيم O-Glycosidase من NEB (NEB# P0733) فسيزيل الكربوهيدرات المرتبطة برابطة O من النوعين الأساسيين 1 و3 والمرتبطة بالسيرين\/الثريونين. إذا لم تلاحظ إزالة الغليكوزيل، وكنتَ تعلم أن البروتين يحتوي على غليكانات N، ففكّر في إضافة المزيد من الإنزيم واستخدام فترات حضانة أطول. إذا اخترتَ تغيير طبيعة البروتين السكري، فتأكد من إضافة NP-40 (لحماية إنزيم PNGase F المُعاد تركيبه من SDS في خطوة تغيير الطبيعة). خارج ظروف التفاعل هذه، هناك احتمال أن تكون الكربوهيدرات مقاومة لإنزيم PNGase F المُعاد تركيبه (وهو أمر نادر الحدوث). يحدث هذا عندما يتم تعديل N-أسيتيل غلوكوزامين الأساسي بواسطة α1-3Fucose (يوجد غالبًا في بروتينات النباتات والحشرات). س: ما الفرق بين PNGase F وRemove-iT® PNGase F؟ ج: يتم تنقية كل من PNGase F وRemove-iT® PNGase F من نفس المصدر وبنفس الخصوصية. تم التعبير عن Remove-iT PNGase F مع علامة نطاق ربط الكيتين (CBD) للسماح بإزالة الإنزيم بسهولة من التفاعل. لا يؤثر الوسم على خصوصية الإنزيم أو نشاطه. عند استخدامه في ظروف مُفسِخة، يكون تركيز كل من PNGase F وRemove-iT® PNGase F متساويًا. مع ذلك، يُباع Remove-iT® PNGase F بوحدة مُفسِخة مُعدّلة (DTT فقط، بدون SDS) لجعله متوافقًا مع مطياف الكتلة. س: ما الفرق بين Remove-iT® PNGase F وEndo H؟ ج: يُزيل Remove-iT® PNGase F جميع أنواع الغلكزة المرتبطة بالنيتروجين (المرتبطة بالأسباراجين)؛ بما في ذلك الغلكزة عالية المانوز، والهجينة، وثنائية، وثلاثية، ورباعية الروابط. يُنصح باختيار هذا الإنزيم إذا كان الهدف هو إزالة جميع الكربوهيدرات المرتبطة بالنيتروجين بغض النظر عن نوعها. أما Endo H فيُزيل فقط الغلكزة عالية المانوز وبعض أنواع الكربوهيدرات الهجينة المرتبطة بالنيتروجين. يمكنك اختيار هذا الإنزيم لتحديد نوع الارتباط بالجليكوزيل N بدقة أكبر، أو إذا كنت تعلم أن البروتين يحتوي على كربوهيدرات حساسة لإنزيم Endo H. س: ما هي كمية Remove-iT® PNGase F التي يجب استخدامها لإزالة الكربوهيدرات في الظروف الطبيعية أو ظروف التمسخ باستخدام DTT؟ ج: عندما لا يتم تمسخ البروتين باستخدام SDS، يجب أن يبذل Remove-iT® PNGase F جهدًا أكبر للوصول إلى موقع انقسام الكربوهيدرات (بسبب البنية الثانوية والثالثية للبروتين). في بعض الأحيان، قد يساعد استخدام كمية إضافية من الإنزيم وفترات حضانة أطول، لكن هذه القيم خاصة بكل بروتين ويجب تحديدها تجريبيًا. س: هل يعمل Remove-iT® PNGase F في اليوريا؟ ج: إنزيم PNGase F مستقر في محلول يوريا بتركيز 2.5 مولار عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة، ويحتفظ بنسبة 40% من نشاطه في محلول يوريا بتركيز 5 مولار. 1. مالي، ف.، وآخرون، الكيمياء الحيوية التحليلية، 180، 195-204 (1989) س: ما هي ظروف التفاعل النموذجية لـ Remove-iT® PNGase F؟ ج: ظروف التفاعل النموذجية هي كما يلي: يجب تحديد أوقات الحضانة المثلى وتركيزات الإنزيم تجريبياً لركيزة معينة. امزج 10-20 ميكروغرام من البروتين السكري، و1 ميكرولتر من محلول DTT بتركيز 40 ملي مولار، والماء (إذا لزم الأمر) للوصول إلى حجم تفاعل إجمالي قدره 10 ميكرولتر. قم بتعطيل البروتين السكري بتسخين التفاعل عند 55 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. ارفع حجم التفاعل الإجمالي إلى 20 ميكرولتر بإضافة 2 ميكرولتر من محلول GlycoBuffer 2 بتركيز 10X، والماء، و1-5 ميكرولتر من إنزيم Remove-iT® PNGase F. حضّن التفاعل عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. ملاحظة: يمكن زيادة حجم التفاعلات خطيًا لاستيعاب أحجام تفاعل أكبر. س: كيف يمكنني إزالة إنزيم Remove-iT® PNGase F من التفاعل؟ ج: يمكن إزالة إنزيم Remove-iT® PNGase F من تفاعل إزالة الغليكوزيل باستخدام خرز الكيتين المغناطيسي من شركة NEB. فيما يلي ظروف التفاعل النموذجية لإزالة 1-5 ميكرولتر من إنزيم Remove-iT® PNGase F باستخدام خرز الكيتين المغناطيسي: كما يلي: المواد: Remove-iT® PNGase F (NEB #P0706)، خرز مغناطيسي من الكيتين (NEB #E8036)، حامل فصل مغناطيسي (NEB #S1506 أو NEB #S1509). ضع 50 ميكرولتر من خرز الكيتين المغناطيسي في أنبوب إيبندورف، ثم ضع الأنبوب في حامل الفصل المغناطيسي. دع المغناطيس يجذب خرز الكيتين، ثم اسحب السائل الطافي وتخلص منه. مع بقاء أنبوب الإيبندورف على حامل الفصل المغناطيسي، اغسل خرز الكيتين المغناطيسي مرتين (500 ميكرولتر في كل مرة) بمحلول فورمات الأمونيوم 50 ملي مولار، درجة الحموضة 4.4 (أو محلول منظم من اختيارك). اسحب السائل الطافي وتخلص منه. أضف عينة البروتين السكري منزوع الغليكوزيل إلى أنبوب الإيبندورف مع خرز الكيتين المغناطيسي. رجّ عينة البروتين السكري منزوع الغليكوزيل مع خرز الكيتين المغناطيسي لمدة 10 دقائق عند درجة حرارة 4 درجات مئوية. أعد أنبوب الإيبندورف إلى مكانه. على حامل الفصل المغناطيسي، دع المغناطيس يجذب حبيبات الكيتين. اسحب السائل الطافي باستخدام ماصة واحتفظ به. اغسل حبيبات الكيتين المغناطيسية 3 × 100 ميكرولتر بمحلول فورمات الأمونيوم 50 ملي مولار عند درجة حموضة 4.4 (أو محلول منظم من اختيارك). اسحب السائل الطافي من كل غسلة واحتفظ به. اجمع جميع السوائل الطافية من الخطوتين 5 و6، لأنها تمثل البروتين السكري منزوع الغليكوزيل. حلل العينة بالطريقة التي تختارها. ملاحظة: يمكن زيادة إزالة إنزيم Remove-iT® PNGase F من تفاعل إزالة الغليكوزيل خطيًا بزيادة حجم حبيبات الكيتين المغناطيسية. س: ما هي سعة ارتباط حبيبات الكيتين المغناطيسية المستخدمة لإزالة إنزيم Remove-iT® PNGase F؟ ج: تبلغ سعة ارتباط حبيبات الكيتين المغناطيسية (NEB# E8036) حوالي 0.4 ملغ\/مل من البروتين الموسوم بـ CBD. تُحسب سعة الارتباط هذه بوحدة ملغ من البروتين لكل حجم من الراتنج. حبيبات الكيتين المغناطيسية هي معلق بنسبة 50:50. بالتالي، ينتج عن 50 ميكرولتر من المعلق حجم 25 ميكرولتر من الراتنج، وهو ما يكفي لإزالة 1-5 ميكرولتر من إنزيم Remove-iT® PNGase F. س: هل إنزيم Remove-iT® PNGase F متوافق مع التحليلات اللاحقة مثل HPLC وقياس الطيف الكتلي؟ ج: يُزوَّد إنزيم Remove-iT® PNGase F في محلول تخزين مناسب لقياس الطيف الكتلي وخالٍ من الجلسرين. لا يتوافق محلول تمسخ البروتينات السكرية (الذي يحتوي على SDS وDTT) مع تطبيقات قياس الطيف الكتلي، وغالبًا ما يصعب إزالته من التفاعل. لذلك، يعتمد تعريف وحدة إنزيم Remove-iT® PNGase F على بروتوكول تمسخ جزئي باستخدام DTT فقط، بدون SDS، مما يجعل التفاعل متوافقًا مع التحليلات اللاحقة باستخدام HPLC وMS. س: لماذا غيّرت إنزيمات NEB Glycosidase محاليل التفاعل؟ ما هي محاليل التفاعل الجديدة، وهل لا يزال بإمكاني استخدام الإنزيم مع محلوله القديم؟ أين يمكنني العثور على التركيب؟ هل تم تغيير المحاليل المنظمة القديمة؟ ج: لتبسيط إجراءات العمل والهضم باستخدام اثنين أو أكثر من الإكسوغليكوزيداز، يتم الآن تزويد معظم الإنزيمات بمحلول غليكوبافر 1 بتركيز 10X. ويُستثنى من ذلك إنزيمان يتم تزويدهما بمحلول غليكوبافر 4. كما تم تبسيط مجموعة المحاليل المنظمة للإندوغليكوزيداز. تم تقييم نشاط كل إنزيم إندو- وإكسوغليكوزيداز في كل من نظام المحلول المنظم القديم والجديد. احتفظت جميع الإنزيمات إما بنفس النشاط، أو وُجد أن نشاطها أكبر في المحلول المنظم الجديد. لا يزال يتم تزويد بعض الإكسوغليكوزيداز بقارورة إضافية من rHSA (يعزز rHSA نشاط بعض الإنزيمات). وكما كان من قبل، لا يزال يتم تزويد بعض الإكسوغليكوزيداز بقارورة إضافية من BSA (يعزز BSA نشاط بعض الإنزيمات). لا تزال المكونات الأخرى (مثل محلول تمسخ البروتين السكري، NP-40، إلخ) متوفرة عند الحاجة. رقم منتج الإنزيم، المحلول المنظم القديم، المحلول المنظم الحالي، هل تم التغيير؟ إنزيم ألفا-إن-أسيتيل جالاكتوزامينيداز P0734 G7 جليكوبافر 1 نعم، إنزيم ألفا1-2 فوكوسيداز P0724 G4 جليكوبافر 1 نعم، إنزيم ألفا1-2،3،4،6 فوكوسيداز P0748 --- جليكوبافر 1 --- إنزيم ألفا1-2،4،6 فوكوسيداز O p0749 --- جليكوبافر 1 --- إنزيم ألفا1-3،4 فوكوسيداز p0769 --- جليكوبافر 1 --- إنزيم ألفا1-2،3 مانوسيداز P0729 G6 جليكوبافر 1 لا، إنزيم ألفا1-6 مانوسيداز P0727 G2 جليكوبافر 1 نعم، إنزيم ألفا1-2،3،6 مانوسيداز p0768 --- جليكوبافر 4 --- غالاكتوزيداز α1-3,4,6 P0747 --- غليكوبافر 1 ---- غالاكتوزيداز α1-3,6 P0731 G6 غليكوبافر 1 لا نيورامينيداز α2-3 S P0743 --- غليكوبافر 1 --- نيورامينيداز α2-3,6,8 P0720 G1 غليكوبافر 1 نعم نيورامينيداز α2-3,6,8,9 A P0722 --- غليكوبافر 1 --- β-N-أسيتيل هيكسوزامينيداز P0721 G2 غليكوبافر 1 نعم β-N-أسيتيل غلوكوزامينيداز P0732 G1 غليكوبافر 1 نعم β-N-أسيتيل غلوكوزامينيداز S P0744 --- غليكوبافر 1 --- β1-3 جالاكتوزيداز P0726 G6 GlycoBuffer 1 لا β1-4 جالاكتوزيداز S P0745 --- GlycoBuffer 1 --- β1-3,4 جالاكتوزيداز p0746 --- GlycoBuffer 4 --- N-Glycan Sequencing Kit E0577 --- GlycoBuffer 1 --- Endo S P0741 G6 GlycoBuffer 1 نعم Endo H P0702 G5 GlycoBuffer 3 نعم Endo Hf P0703 G5 GlycoBuffer 3 نعم Endo F2 p0772 --- GlycoBuffer 4 --- Endo F3 p0771 --- GlycoBuffer 4 --- Endo D P0742 G7 GlycoBuffer 2 لا O-Glycosidase P0733 G7 مجموعة GlycoBuffer 2 بدون O-Glycosidase و Neuraminidase E0540 G7 GlycoBuffer 2 بدون Remove-iT® PNGase F P0706 G7 GlycoBuffer 2 بدون PNGase F P0704 G7 GlycoBuffer 2 بدون PNGase F (خالي من الجلسرين) P0705 G7 GlycoBuffer 2 بدون PNGase F، مُعاد التركيب P0708 G7 GlycoBuffer 2 بدون PNGase F (خالي من الجلسرين)، مُعاد التركيب P0709 G7 GlycoBuffer 2 بدون PNGase A p0707 --- Glyco Buffer 3 --- مزيج إزالة الغليكوزيل من البروتين II p6044 --- مزيج إزالة الغليكوزيل Buffer 1 و 2 --- Rapid PNGase F P0710 --- Rapid PNGase F Buffer ---- Rapid™ PNGase F (صيغة غير مُختزلة) p0711 --- محلول منظم سريع لإنزيم PNGase F (صيغة غير مختزلة) س: ما هو الركيزة المناسبة لإنزيم الإندوغليكوزيداز؟ ج: بالنسبة لإنزيم PNGaseF ومزيج إزالة الغليكوزيل من البروتين، نقترح استخدام فيتوين (NEB #P6042، المرفق مع مزيج إزالة الغليكوزيل من البروتين). بالنسبة لإنزيم PNGaseF، وإنزيم Endo H، وإنزيم Endo Hf، نقترح استخدام RNase B (NEB #P7817). بالنسبة لإنزيم Endo D، نقترح استخدام فوسفوليباز A من سم النحل. بالنسبة لإنزيم Endo S، نقترح استخدام IgG أحادي النسيلة من الفأر (NEB #E8032). بالنسبة لإنزيم O-غليكوزيداز، نقترح استخدام p-نيتروفينيل غالاكتو-N-بيوسيد (Galβ1-3GalNAcα1pNP، أو Core1-pNP). بدلاً من ذلك، يمكن هضم فيتوين باستخدام نيورامينيداز، أو نيورامينيداز مع إنزيم O-غليكوزيداز. يمكن ملاحظة التغيرات في الوزن الجزيئي بعد إزالة الغليكان. تمت الملاحظة بواسطة SDS-PAGE. س: هل تُثبّط المنظفات الإكسوجليكوزيداز\/الإندوجليكوزيداز؟ ج: عند مستويات معتدلة (0.5-1.0% من المنظفات الأيونية وغير الأيونية)، تُظهر معظم الجليكوزيدازات نشاطًا مُرضيًا أو لا تتأثر. الاستثناءات هي: PNGase F (جميع التركيبات)، وO-جليكوزيداز، وβ-N-أسيتيل جلوكوزامينيداز، والتي يتم تثبيطها بواسطة SDS. من الضروري إضافة NP-40 بتركيز نهائي 1% إلى خليط التفاعل لمواجهة تثبيط المنظفات. يتم تثبيط Endo D أيضًا بواسطة SDS، ولكن NP-40 لا يُعاكس هذا التثبيط. أخيرًا، يمكن أن تمنع الكواشف المُثبتة الشائعة مثل Tween وTriton X-100 وNP-40 وأوكتيل جلوكوزيد وسلفوبيتينات غير المنظفة، بالإضافة إلى آثار المذيبات العضوية، التفاعل السريع الأمثل إزالة الغليكوزيل بواسطة إنزيم Rapid PNGase F. س: ما هي الغليكوزيدازات وما استخداماتها؟ ج: تُستخدم الغليكوزيدازات للحصول على معلومات حول مجموعات الكربوهيدرات المرتبطة بالبروتينات السكرية والببتيدات السكرية. وهي نوعان: الغليكوزيدازات الداخلية التي تفصل مجموعات الكربوهيدرات الكاملة عن البروتينات، والغليكوزيدازات الخارجية التي تزيل السكريات الأحادية من النهايات غير المختزلة للكربوهيدرات. أما النهاية المختزلة فهي تلك التي يُنتجها الغليكوزيداز الداخلي. غالبًا ما يستخدم الباحثون غليكوزيدازًا داخليًا متبوعًا بواحد أو أكثر من الغليكوزيدازات الخارجية، ثم يحللون النواتج باستخدام SDS-PAGE أو أنواع مختلفة من الاستشراب السائل.","brand":"New England Biolabs","offers":[{"title":"Default Title","offer_id":46835519488169,"sku":"P0706S","price":0.99,"currency_code":"USD","in_stock":true}],"url":"https:\/\/iright.com\/ar\/products\/neb-p0706s","provider":"Iright","version":"1.0","type":"link"}