{"product_id":"neb-r3132l","title":"نيو إنجلاند بيولابس، R3132L، SspI-HF®","description":"تمت إعادة صياغة SspI-HF باستخدام الألبومين المؤتلف (rAlbumin) بدءًا من رقم الدفعة 10141296. \u003cb\u003eالفئات ذات الصلة:\u003c\/b\u003e إنزيمات القطع المحددة S، إنزيمات القطع المحددة عالية الدقة (HF®)، إنزيمات القطع المحددة الموفرة للوقت. \u003cb\u003eالتطبيقات:\u003c\/b\u003e الاستنساخ السريع: تسريع عمليات الاستنساخ باستخدام كواشف من NEB. \u003cb\u003eمواصفات\u003c\/b\u003e هضم إنزيم القطع \u003cb\u003e: تعريف الوحدة\u003c\/b\u003e : تُعرَّف الوحدة الواحدة بأنها كمية الإنزيم اللازمة لهضم 1 ميكروغرام من الحمض النووي λ في ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية في حجم تفاعل إجمالي قدره 50 ميكرولتر. \u003cb\u003eشروط التفاعل:\u003c\/b\u003e محلول rCutSmart™ بتركيز 1X، يُحضن عند 37 درجة مئوية. محلول rCutSmart™ بتركيز 1X، 50 ملي مولار أسيتات البوتاسيوم، 20 ملي مولار أسيتات التريس، 10 ملي مولار أسيتات المغنيسيوم، 100 ميكروغرام\/مل ألبومين مُعاد التركيب (الأس الهيدروجيني 7.9 عند 25 درجة مئوية). \u003cb\u003eالنشاط في محاليل\u003c\/b\u003e NEBuffer™: NEBuffer™ r1.1: 25%، NEBuffer™ r2.1: 100%، NEBuffer™ r3.1: \u0026lt;10%، محلول rCutSmart™: 100%. \u003cb\u003eتوافق المخفف\u003c\/b\u003e : المخفف B، \u003cb\u003eمحلول التخزين\u003c\/b\u003e : 10 ملي مولار تريس-هيدروكلوريد، 200 ملي مولار كلوريد الصوديوم، 1 ملي مولار DTT، 0.1 ملي مولار EDTA، 200 ميكروغرام\/مل ألبومين مُعاد التركيب، 50% جلسرين، الأس الهيدروجيني 7.4 عند 25 درجة مئوية. \u003cb\u003eتعطيل الإنزيم بالحرارة\u003c\/b\u003e عند 25 درجة مئوية، ثم عند 65 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. \u003cb\u003eحساسية المثيلة\u003c\/b\u003e : مثيلة dam: غير حساسة، مثيلة dcm: غير حساسة، مثيلة CpG: غير حساسة. \u003cb\u003eالأسئلة الشائعة:\u003c\/b\u003e س: هل يوجد فرق في القطع بالقرب من الأطراف بين SspI-HF وSspI؟ ج: لا. عند اختبارهما على سلسلة من خمسة أوليغومرات (بطول 19-23 قاعدة) تحتوي على موقع التقييد وقاعدة A\/T إضافية من 1 إلى 5 من النهاية، يقطع كلا الإنزيمين الأوليغومر على بعد زوجين من القواعد من النهاية. عند تصميم البادئات، توصي NEB بإضافة 6 قواعد إضافية لضمان عدم فشل التجربة بسبب اختلاف الركيزة وظروف التفاعل. س: هل يوجد أي فرق في حساسية المثيلة بين SspI-HF وSspI؟ ج: لا يتأثر أي من SspI-HF أو SspI بمثيلة EcoBI المتداخلة. للحصول على معلومات أكثر تحديدًا حول المثيلة، اتبع الرابط إلى قاعدة بيانات إنزيمات التقييد REBASE. س: ما الفرق بين SspI-HF وSspI؟ ج: يُنتَج SspI-HF في بكتيريا الإشريكية القولونية من سلالة تحمل جين SspI المُستنسخ والمُعدَّل من نوع Sphaerotilus (ATCC 13925). س: متى يجب عليّ اختيار نسخة HF من الإنزيم؟ ج: تتمتع نسخة HF من الإنزيم بنفس خصوصية القطع التي يتمتع بها الإنزيم الأصلي، ويجب اختيارها إذا كان النشاط الزائد مصدر قلق أو إذا كان المحلول المُوصى به أكثر ملاءمة للهضم المزدوج أو أي بروتوكول متعدد الخطوات. لا توجد أي عيوب لاستخدام نسخة HF. س: متى يكون النشاط الزائد مصدر قلق؟ ج: يكون النشاط الزائد مصدر قلق إذا كان ظهور نطاقات إضافية قد يؤدي إلى سوء تفسير النتائج في إجراءات تحديد النمط الجيني وتحليل الطفرات. يمكن أن يُؤدي تصميم التجربة إلى زيادة النشاط الزائد. من المرجح أن تحتوي أحجام التفاعل الصغيرة على تركيزات من الجلسرين تبلغ 5% أو أكثر، وهي حالة معروفة بزيادة النشاط النجمي. يحدث تركيز جلسرين بنسبة 5% عند إجراء هضم مزدوج في تفاعل حجمه 20 ميكرولتر باستخدام 1 ميكرولتر من كل إنزيم. من المرجح أن تؤدي عمليات الهضم التي تستغرق ليلة كاملة إلى توليد نشاط نجمي. للحصول على نصائح حول تجنب النشاط النجمي، يرجى النقر هنا. س: لماذا يختلف المحلول المنظم الموصى به لنسخة HF من الإنزيم عن الإنزيم الأصلي؟ ج: في كثير من الحالات، يؤدي تغيير الأحماض الأمينية المشحونة لجين إنزيم القطع إلى تغييرات في تفضيل المحلول المنظم. يمكن أن تكون هذه التغييرات كبيرة. على سبيل المثال، يتطلب إنزيم SalI الأصلي بشدة استخدام NEBuffer r3.1، وهو محلول منظم ذو قوة أيونية عالية. ومع ذلك، يعمل SalI-HF بشكل جيد في NEBuffer r2.1 وrCutSmart Buffer™، وهما محاليل منظمة ذات قوة أيونية متوسطة. س: متى يجب عليّ اختيار نسخة High Fidelity (HF®) من الإنزيم؟ ج: يتمتع إنزيم HF بنفس خصوصية القطع التي يتمتع بها الإنزيم الأصلي، ويُنصح باختياره إذا كان النشاط النجمي مصدر قلق، أو إذا كان المحلول المنظم الموصى به، CutSmart®، أكثر ملاءمةً للهضم المزدوج أو أي بروتوكول آخر متعدد الخطوات. في بعض الحالات، قد تختلف إنزيمات HF في درجة حرارة (أو مدة) تعطيلها بالحرارة، وتحملها للملوحة، وخصائص مثيلتها (نادرًا). تعرف على المزيد حول إنزيمات التقييد عالية الدقة. س: هل يمكن أن يكون تغيير تفضيل المحلول المنظم لإنزيم HF مفيدًا؟ ج: جميع إنزيمات التقييد HF مزودة بمحلول rCutSmart® المنظم. عادةً ما يكون لإنزيمات HF محلول منظم مثالي مختلف عن الإنزيم الأصلي؛ وهذا قد يكون مفيدًا عند تصميم تجارب الهضم المزدوج. تم اختيار محلول rCutSmart® المنظم الموصى به لإنزيمات HF لأنه يُظهر أعلى مستوى من توافق الإنزيم مع نظام محاليل NEB المنظمة. س: هل سيُنتج إنزيم HF نشاطًا نجميًا مرتفعًا عند استخدامه في محلول منظم غير الموصى به؟ ج: تم اختبار نشاط الإنزيم النجمي على نطاق واسع في جميع محاليل NEBuffers التي أظهرت نشاطًا إنزيميًا بنسبة 50% على الأقل. ينخفض ​​نشاط الإنزيم النجمي بشكل ملحوظ مقارنةً بنشاط الإنزيم الطبيعي في جميع محاليل NEBuffers. مع ذلك، نوصي باستخدام محلول التفاعل المقترح كلما أمكن، لأنه في بعض الحالات قد يظل نشاط الإنزيم النجمي إشكاليًا في ظل ظروف قاسية عند استخدام محاليل غير موصى بها. س: ما معنى أن يكون الإنزيم مؤهلًا لتقنية Time-Saver™؟ ج: الإنزيمات المؤهلة لتقنية Time-Saver™ تهضم وحدة ركيزة الاختبار في غضون 5-15 دقيقة في ظل ظروف التفاعل الموصى بها، ويمكن استخدامها بأمان في عمليات الهضم التي تستغرق ليلة كاملة. س: كيف يتم قياس تحسن دقة إنزيمات القطع HF؟ ج: يُقاس نشاط الإنزيم النجمي باستخدام مؤشر الدقة (FI). يمكن مقارنة مؤشر الدقة لإنزيم القطع الطبيعي مباشرةً بنظيره المُعدَّل من HF. س: ما هو مؤشر الدقة (FI)؟ ج: يُعرَّف مؤشر الدقة (FI) بأنه نسبة الحد الأقصى لكمية الإنزيم التي لا تُظهر أي نشاط نجمي إلى الحد الأدنى من الكمية اللازمة للهضم الكامل في موقع التعرف الخاص بأي إنزيم نوكلياز تقييدي معين. تُترجم قيمة FI إلى الحد الأدنى من الوحدات المطلوبة لإنتاج النشاط النجمي. يمكن أن تتأثر قيمة FI بالركيزة والمحلول المنظم والمواد المضافة مثل الجلسرين. يشرح المرجع التالي كيفية تحديد مؤشر الدقة. هوا وي وآخرون، \"يوفر مؤشر الدقة قياسًا كميًا منهجيًا للنشاط النجمي لإنزيمات نوكلياز التقييد DNA\"، مجلة أبحاث الأحماض النووية، 2008، المجلد 36، العدد 9: e50. س: ماذا يشير HF® بعد اسم إنزيم التقييد؟ ج: يشير HF® إلى الدقة العالية. العديد من إنزيمات نوكلياز التقييد قادرة على قطع تسلسلات مشابهة ولكنها ليست مطابقة لتسلسل التعرف المحدد لها. يُطلق على هذه الخصوصية المتغيرة أو المُخففة اسم النشاط النجمي. تم تصميم إنزيمات القطع عالية الدقة (HF) لتقطع بدقة أعلى من الإنزيم الطبيعي، مما يقلل من نشاطها غير المرغوب فيه. استُخدمت تقنيات فحص بتركيزات متزايدة من الجلسرين، ووقت تفاعل أطول، وتركيز عالٍ من الإنزيم لتحديد الإنزيمات التي توفر أعلى دقة في ظل ظروف متنوعة. بالإضافة إلى ذلك، تُزود جميع إنزيمات HF بمحلول rCutSmart Buffer™، بالإضافة إلى قارورة مجانية من صبغة التحميل البنفسجية. تعرّف على المزيد حول إنزيمات القطع عالية الدقة هنا. س: هل يجب عليّ تحضير عملية الهضم باستخدام إنزيمات Time-Saver™ لمدة 5-15 دقيقة؟ هل يمكنني الهضم لفترة أطول؟ ج: تتميز إنزيمات Time-Saver™ من NEB بسرعة عملها (5-15 دقيقة)، كما أنها مصممة ومؤهلة لتحمل عمليات الهضم طوال الليل دون إتلاف الحمض النووي. س: اختبرت إنزيم القطع الخاص بكم على الحمض النووي الموصى به من NEB، ويبدو أنه نشط، ولكنه لا يهضم الحمض النووي الخاص بي. ما السبب المحتمل؟ ج: تُعد جودة ونقاء الحمض النووي من العوامل الرئيسية التي تؤثر على نشاط الإنزيم. قد تُثبط الأملاح الموجودة في التفاعل إنزيمات القطع النشطة في محلول rCutSmart®، ولكنها أقل نشاطًا في محلول NEBuffer r2.1 و\/أو r3.1 (محاليلنا ذات التركيز الملحي العالي). قد تُؤدي إجراءات تنقية الحمض النووي التي تستخدم أعمدة الطرد المركزي إلى محاليل حمض نووي ذات مستويات عالية من الأملاح، والتي قد تنتقل إلى التفاعل وتُثبط نشاط الإنزيم. لتجنب ذلك، نوصي بألا تتجاوز كمية محلول الحمض النووي المُضاف إلى التفاعل 25% من إجمالي حجم التفاعل. يُمكن تحقيق ذلك بتعديل إجمالي حجم التفاعل وفقًا لذلك. س: هل يُمكن تخزين صبغة تحميل الجل، بنفسجي 6X (B7024) في درجات حرارة منخفضة؟ ج: درجة حرارة التخزين المُوصى بها لصبغة تحميل الجل، بنفسجي 6X، هي درجة حرارة الغرفة (25 درجة مئوية). عادةً، قد يترسب كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS) من المحلول عند تخزين الصبغة في درجات حرارة منخفضة. يمكن التخلص من هذا الراسب الطفيف بترك القارورة في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة، أو بتسخينها برفق لمدة 10 دقائق. رجّ القارورة عدة مرات قبل الاستخدام لإعادة المحلول إلى تجانسه. س: ما هي إنزيمات التقييد من NEB التي تأتي مع صبغة تحميل الجل، بنفسجية (6X)؟ ج: جميع إنزيمات التقييد HF ومعظم إنزيمات التقييد غير HF من NEB تأتي مع صبغة تحميل الجل، بنفسجية (6X). الإنزيمات المقيدة غير HF التي تأتي مع الصبغة الأرجوانية هي: AatII AsiSI BsmBI-v2 EagI MboI NlaIII PvuI SmaI Acil AvrII BspHI EcoRI MboII NotI RsaI SpeI AfeI BamHI BsrGI EcoRV MluI NspI SacI StuI AflII BbsI ClaI Esp3I FseI MseI PacI SacII AgeI BglII DdeI HaeIII MspI PciI Sali XbaI AluI BsaI DpnI HindIII NcoI PmeI SapI XhoI ApaI BseYI DpnII HpaI NdeI PsiI-v2 SfaNI XmaI ApeKI BsiWI DraI KpnI NheI PstI SfiI XmnI AscI * يتم أيضًا توفير جميع إنزيمات تقييد HF مع تحميل الجل صبغ، بنفسجي (6X) س: هل هذا هل هذا الإنزيم حساس لـ dam أو dcm أو مثيلة CpG في الثدييات؟ ج: لا. هذا الإنزيم غير حساس لـ dam أو dcm أو مثيلة CpG في الثدييات. للحصول على أحدث المعلومات حول حساسية المثيلة، يُرجى زيارة صفحة Dam-Dcm ومثيلة CpG أو REBASE. س: هل يمكنك إخباري المزيد عن التحول من BSA إلى الألبومين المُعاد تركيبه (rAlbumin) في محاليل NEBuffers؟ ج: يسرّ NEB أن تُعلن عن استبدال محاليل التفاعل المحتوية على BSA (NEBuffer 1.1، 2.1، 3.1 وCutSmart® Buffer) بمحاليل تحتوي على الألبومين المُعاد تركيبه (NEBuffer r1.1، r2.1، r3.1 وrCutSmart™ Buffer). كما أننا بصدد تحويل جميع تركيبات إنزيمات التقييد لتشمل rAlbumin. نرى أن الابتعاد عن المنتجات التي تحتوي على مكونات حيوانية خطوة في الاتجاه الصحيح، ونستطيع تقديم هذا التحسين بنفس السعر. س: هل يمكنني استخدام NEBuffer EcoRI\/SspI مع SspI-HF؟ ج: لا ننصح باستخدام SspI-HF مع NEBuffer EcoRI\/SspI. يُزوَّد SspI-HF بمحلول rCutSmart Buffer لتحقيق أفضل فعالية. تبلغ فعاليته أقل من 10% في NEBuffer EcoRI\/SspI. س: هل صبغة تحميل الجل، بنفسجية (6X) أو صبغة تحميل الجل، بنفسجية (6X)، بدون SDS متوافقة مع أصباغ ربط الحمض النووي الأخرى مثل SYBR® وGelRed™ أثناء الفصل الكهربائي الهلامي؟ ج: نظرًا لأن أصباغ ربط الأحماض النووية عالية الألفة قد تؤثر على هجرة الحمض النووي أثناء الفصل الكهربائي، يُوصى بشدة بتلوين الهلامات بصبغات SYBR أو GelRed بعد الفصل. مع ذلك، يمكن أيضًا استخدام هذه الأصباغ كأصباغ مُسبقة الصب (في هلام الأغاروز). نظرًا لزيادة تركيز صبغة تحميل الجل البنفسجية (6X) في SDS، قد تُلاحظ بعض التداخلات عند استخدام SYBR أو GelRed كصبغات مُسبقة الصب. عند استخدام هذه الصبغات، توصي NEB باستخدام صبغة تحميل الجل البنفسجية الخالية من SDS (6X) (NEB #B7025S) بدلاً منها. يُرجى اتباع التوصيات التالية لكلا الصبغتين البنفسجيتين عند استخدام صبغات SYBR كصبغات مُسبقة الصب: قلل كمية الحمض النووي المُحمّل إلى 250-500 نانوغرام، واستخدم 0.5X فقط من صبغات SYBR في الجل المُسبق الصب. هذه الصبغات أكثر حساسية من EtBr. قد يؤدي التحميل الزائد إلى ظهور حزم غير واضحة أو مُلطخة. في حال استخدام صبغة تحميل الجل البنفسجية (6X) B7024S، استخدم محلول TBE بدلاً من محلول TAE، حيث تزداد تداخلات SDS عند استخدام محلول TAE (في الجل وكسائل تشغيل). استخدم أصباغ SYBR وفقًا لتوصيات الشركة المصنعة: أضف صبغة SYBR إلى محلول TBE أولًا، ثم أضف مزيج صبغة SYBR\/TBE إلى محلول الأغاروز المنصهر. يُفضل الانتظار بضع دقائق قبل إضافة أصباغ SYBR إلى الأغاروز المنصهر. تُعطي إضافتها إلى محلول أغاروز مُبرد (أعلى من درجة حرارة التجلط، 45 درجة مئوية) نتائج أفضل. قم دائمًا بتشغيل هلام أغاروز مُحضر حديثًا، لمرة واحدة فقط. إعادة تشغيل الهلام ستؤدي إلى نتائج ضعيفة. يُرجى اتباع التوصيات التالية لكلا الصبغتين البنفسجيتين عند استخدام أصباغ GelRed كأصباغ مُسبقة الصب: قلل كمية الحمض النووي المُحمّل إلى 60 إلى 125 نانوغرام، واستخدم 0.5X فقط من صبغة GelRed في الهلامات مُسبقة الصب. هذه الصبغة أكثر حساسية من EtBr. قد يتسبب التحميل الزائد في ظهور حزم غير واضحة أو مُلطخة. يُفضل الانتظار بضع دقائق قبل إضافة صبغة GelRed إلى الأغاروز المنصهر. إضافة هذا المنتج إلى محلول أجاروز مُبرد (أعلى من درجة حرارة التجلط، 45 درجة مئوية) يُحسّن النتائج. يُنصح دائمًا بتشغيل هلام أجاروز مُحضّر حديثًا، لمرة واحدة فقط. إعادة تشغيل الهلام ستؤدي إلى نتائج غير مرضية. SYBR® علامة تجارية مسجلة لشركة Life Technologies Corporation، وGelRed™ علامة تجارية لشركة Biotium.","brand":"New England Biolabs","offers":[{"title":"Default Title","offer_id":46835505299625,"sku":"R3132L","price":0.99,"currency_code":"USD","in_stock":true}],"url":"https:\/\/iright.com\/ar\/products\/neb-r3132l","provider":"Iright","version":"1.0","type":"link"}