{"product_id":"neb-r3195t","title":"نيو إنجلاند بيولابس، R3195T، EcoRV-HF®","description":"تتمتع بنفس خصوصية الإنزيمات الأصلية، ولكنها مصممة هندسيًا لتقليل نشاطها وأدائها بشكل ملحوظ في محلول منظم واحد. ( \u003cb\u003eالفئات ذات الصلة:\u003c\/b\u003e إنزيمات القطع المحددة CG، إنزيمات القطع المحددة عالية الدقة (HF®)، إنزيمات القطع المحددة الموفرة للوقت. \u003cb\u003eالتطبيقات:\u003c\/b\u003e الاستنساخ السريع: تسريع عمليات الاستنساخ باستخدام كواشف من NEB. \u003cb\u003eمواصفات\u003c\/b\u003e هضم إنزيم القطع: \u003cb\u003eتعريف الوحدة:\u003c\/b\u003e تُعرَّف الوحدة الواحدة بأنها كمية الإنزيم اللازمة لهضم 1 ميكروغرام من الحمض النووي λ في ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية في حجم تفاعل إجمالي قدره 50 ميكرولتر. \u003cb\u003eظروف التفاعل:\u003c\/b\u003e محلول منظم rCutSmart™ بتركيز 1X، يُحضن عند 37 درجة مئوية، محلول منظم rCutSmart™ بتركيز 1X، 50 ملي مولار أسيتات البوتاسيوم، 20 ملي مولار أسيتات التريس، 10 ملي مولار أسيتات المغنيسيوم، 100 ميكروغرام\/مل ألبومين مُعاد التركيب (الأس الهيدروجيني 7.9 عند 25 درجة مئوية) \u003cb\u003eالنشاط في محاليل\u003c\/b\u003e NEBuffer™ r1.1: 25%، NEBuffer™ r2.1: 100%، NEBuffer™ r3.1: 100%، محلول rCutSmart™: 100%. \u003cb\u003eتوافق المخفف:\u003c\/b\u003e \u003cb\u003eمحلول التخزين\u003c\/b\u003e المخفف B: 10 ملي مولار Tris-HCl، 200 ملي مولار NaCl، 1 ملي مولار DTT، 0.1 ملي مولار EDTA، 200 ميكروغرام\/مل BSA، 50% جلسرين، الأس الهيدروجيني 7.4 عند 25 درجة مئوية. \u003cb\u003eالتعطيل الحراري\u003c\/b\u003e : 65 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. \u003cb\u003eحساسية المثيلة\u003c\/b\u003e : مثيلة dam: غير حساسة، مثيلة dcm: غير حساسة، مثيلة CpG: تتأثر ببعض تركيبات التداخل. \u003cb\u003eالأسئلة الشائعة\u003c\/b\u003e : س: هل هناك فرق في القطع بالقرب من الأطراف بين EcoRV-HF وEcoRV؟ ج: لا. عند اختبارها على سلسلة من خمسة أوليغومرات (بطول 19-23 قاعدة) تحتوي على موقع التقييد وقاعدة أو خمس قواعد A\/T إضافية من النهاية، يقطع كلا الإنزيمين الأوليغومر على بُعد زوج قاعدي واحد من النهاية. عند تصميم البادئات، توصي NEB بإضافة 6 قواعد إضافية لضمان عدم فشل التجربة بسبب اختلاف الركيزة وظروف التفاعل. س: ما الفرق بين EcoRV-HF وEcoRV؟ ج: يُنتَج EcoRV-HF في بكتيريا الإشريكية القولونية من سلالة تحمل جين EcoRV المستنسخ والمُعدَّل من البلازميد J62 pLG74 (LI Glatman). س: متى يجب عليّ اختيار نسخة HF من الإنزيم؟ ج: تتمتع نسخة HF من الإنزيم بنفس خصوصية القطع التي يتمتع بها الإنزيم من النوع البري، ويجب اختيارها إذا كان النشاط النجمي مصدر قلق أو إذا كان المحلول المنظم الموصى به أكثر ملاءمة للهضم المزدوج أو أي بروتوكول متعدد الخطوات آخر. لا يوجد عيب في استخدام نسخة HF. س: متى هل يُعدّ النشاط النجمي مصدر قلق؟ ج: يُعدّ النشاط النجمي مصدر قلق إذا كان ظهور نطاقات إضافية قد يُؤدي إلى سوء تفسير النتائج في إجراءات تحديد النمط الجيني وتحليل الطفرات. قد يُؤدي تصميم التجربة إلى زيادة النشاط النجمي. من المرجح أن تحتوي أحجام التفاعل الصغيرة على تركيزات من الجلسرين تبلغ 5% أو أكثر، وهي حالة معروفة بزيادة النشاط النجمي. يحدث تركيز جلسرين بنسبة 5% عند إجراء هضم مزدوج في تفاعل حجمه 20 ميكرولتر باستخدام 1 ميكرولتر من كل إنزيم. من المرجح أن تُؤدي عمليات الهضم التي تستغرق ليلة كاملة إلى توليد النشاط النجمي. للحصول على نصائح حول تجنب النشاط النجمي، يُرجى النقر هنا. س: لماذا يختلف المحلول المنظم الموصى به لنسخة HF من الإنزيم عن الإنزيم من النوع البري؟ ج: في كثير من الحالات، يُؤدي تغيير الأحماض الأمينية المشحونة لجين إنزيم القطع إلى تغييرات في تفضيل المحلول المنظم. قد تكون هذه التغييرات كبيرة. على سبيل المثال، يتطلب إنزيم SalI من النوع البري استخدام NEBuffer r3.1، وهو محلول منظم ذو قوة أيونية عالية. ومع ذلك، يعمل إنزيم SalI-HF بشكل جيد في NEBuffer. r2.1 و rCutSmart Buffer™، وهما محلولان منظمان ذوا قوة أيونية متوسطة. س: متى يجب عليّ اختيار نسخة الإنزيم عالية الدقة (HF®)؟ ج: تتمتع نسخة HF من الإنزيم بنفس خصوصية القطع التي يتمتع بها الإنزيم الأصلي، ويجب اختيارها إذا كان النشاط النجمي مصدر قلق أو إذا كان المحلول المنظم الموصى به، CutSmart®، أكثر ملاءمة للهضم المزدوج أو أي بروتوكول آخر متعدد الخطوات. في بعض الحالات، قد يكون لإنزيمات HF درجة حرارة (أو وقت) مختلفة للتثبيط الحراري، وتحمل مختلف للملوحة، وخصائص مثيلة مختلفة (نادرًا). تعرف على المزيد حول إنزيمات التقييد عالية الدقة. س: هل يمكن أن يكون تغيير تفضيل المحلول المنظم لإنزيم HF مفيدًا؟ ج: جميع إنزيمات التقييد HF مزودة بمحلول rCutSmart® المنظم. عادةً ما يكون لإنزيمات HF محلول منظم مثالي مختلف عن الإنزيم الأصلي؛ وهذا يمكن أن يكون مفيدًا عند تصميم تجارب الهضم المزدوج. تم اختيار محلول rCutSmart المنظم الموصى به لإنزيمات HF نظرًا لأنه يُظهر أعلى مستوى من توافق الإنزيم في نظام NEB buffer. س: هل سيُنتج إنزيم HF نشاطًا نجميًا مرتفعًا عند استخدامه في محلول منظم غير الموصى به؟ ج: تم اختبار النشاط النجمي على نطاق واسع في جميع محاليل NEBuffers التي أظهرت نشاطًا إنزيميًا بنسبة 50% على الأقل. ينخفض ​​النشاط النجمي بشكل ملحوظ مقارنةً بنشاط الإنزيم الأصلي في جميع محاليل NEBuffers. ومع ذلك، نوصي باستخدام محلول التفاعل المقترح كلما أمكن ذلك، لأنه في بعض الحالات قد يظل النشاط النجمي مُشكلًا في ظل ظروف قاسية عند استخدام محاليل منظمة غير موصى بها. س: ما معنى أن يكون الإنزيم مؤهلًا لتقنية Time-Saver™؟ ج: الإنزيمات المؤهلة لتقنية Time-Saver™ تهضم وحدة ركيزة الاختبار في غضون 5-15 دقيقة في ظل ظروف التفاعل الموصى بها، ويمكن استخدامها بأمان أيضًا في عمليات الهضم التي تستغرق ليلة كاملة. س: كيف يتم قياس التحسن في دقة إنزيمات HF المقيدة؟ ج: يُقاس النشاط النجمي باستخدام مؤشر الدقة (FI). يمكن مقارنة مؤشر الدقة لإنزيم القطع الأصلي مباشرةً بنسخة HF المُعدلة. س: ما هو مؤشر الدقة (FI)؟ ج: يُعرَّف مؤشر الدقة (FI) بأنه نسبة الحد الأقصى لكمية الإنزيم التي لا تُظهر أي نشاط مميز إلى الحد الأدنى من الكمية اللازمة للهضم الكامل في موقع التعرف الخاص بأي إنزيم نوكلياز تقييدي معين. تُترجم قيمة FI إلى الحد الأدنى من الوحدات المطلوبة لإنتاج نشاط مميز. يمكن أن تتأثر قيمة FI بالركيزة والمحلول المنظم والمواد المضافة مثل الجلسرين. يشرح المرجع التالي كيفية تحديد مؤشر الدقة. هوا وي وآخرون، \"يوفر مؤشر الدقة قياسًا كميًا منهجيًا للنشاط المميز لإنزيمات نوكلياز التقييد DNA\"، مجلة أبحاث الأحماض النووية، 2008، المجلد 36، العدد 9: e50. س: ماذا يشير HF® بعد اسم إنزيم التقييد؟ ج: يشير HF® إلى الدقة العالية. العديد من إنزيمات نوكلياز التقييد قادرة على قطع تسلسلات مشابهة ولكنها ليست مطابقة لتسلسل التعرف المحدد لها. هذا يُغير أو يُخفف من الخصوصية يُطلق على هذا النشاط اسم \"النشاط النجمي\". تم تصميم إنزيمات القطع HF لتقطع بدقة أعلى من الإنزيم الطبيعي، وبالتالي تُظهر نشاطًا نجميًا أقل. استُخدمت فحوصات باستخدام تركيز متزايد من الجلسرين، ووقت تفاعل أطول، وتركيز عالٍ من الإنزيم لتحديد الإنزيمات التي تُوفر أعلى دقة في نطاق واسع من الظروف. بالإضافة إلى ذلك، تُزود جميع إنزيمات HF بمحلول rCutSmart Buffer™، بالإضافة إلى قارورة مجانية من صبغة التحميل البنفسجية. تعرف على المزيد حول إنزيمات القطع عالية الدقة هنا. س: هل يجب عليّ تحضير عمليات الهضم باستخدام إنزيمات Time-Saver™ لمدة 5-15 دقيقة؟ هل يُمكنني الهضم لفترة أطول؟ ج: تتميز إنزيمات Time-Saver™ من NEB بسرعة عملها (5-15 دقيقة)، كما أنها مُصممة ومُؤهلة لتحمل عمليات الهضم طوال الليل دون تحلل الحمض النووي. س: هل يُمكن تخزين صبغة تحميل الجل، البنفسجية 6X (B7024) في درجات حرارة منخفضة؟ ج: درجة حرارة التخزين المُوصى بها لصبغة تحميل الجل، البنفسجية يُحفظ المحلول بتركيز 6X في درجة حرارة الغرفة (25 درجة مئوية). عادةً، قد يترسب كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS) من المحلول عند تخزين الصبغة في درجات حرارة منخفضة. يمكن التخلص من هذا الراسب الطفيف بترك القارورة في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة، أو بتسخينها برفق لمدة 10 دقائق. يُرجى رجّ القارورة عدة مرات قبل الاستخدام لإعادة المحلول إلى تجانسه. س: ما هي إنزيمات التقييد من شركة NEB المرفقة مع صبغة تحميل الجل البنفسجية (6X)؟ ج: جميع إنزيمات التقييد HF ومعظم إنزيمات التقييد غير HF من شركة NEB مرفقة مع صبغة تحميل الجل البنفسجية (6X). إنزيمات التقييد غير HF المرفقة مع الصبغة البنفسجية هي: AatII AsiSI BsmBI-v2 EagI MboI NlaIII PvuI SmaI Acil AvrII BspHI EcoRI MboII NotI RsaI SpeI AfeI BamHI BsrGI EcoRV MluI NspI SacI StuI AflII BbsI ClaI Esp3I FseI MseI PacI SacII AgeI BglII DdeI HaeIII MspI PciI SalI XbaI AluI BsaI DpnI HindIII NcoI PmeI SapI XhoI ApaI BseYI DpnII HpaI NdeI PsiI-v2 SfaNI XmaI ApeKI BsiWI DraI KpnI NheI PstI SfiI XmnI AscI * جميع إنزيمات التقييد HF مزودة أيضًا بصبغة تحميل الجل، بنفسجية (6X) س: هل هذا الإنزيم حساس لـ dam أو dcm أو مثيلة CpG في الثدييات؟ ج: نعم. لا يستطيع هذا الإنزيم قطع مواقع التعرف في الحمض النووي الجينومي للثدييات التي تتأثر ببعض تركيبات مثيلة CpG المتداخلة. للحصول على معلومات محدثة حول حساسية المثيلة، يرجى زيارة Dam-Dcm ومثيلة CpG أو REBASE. س: هل يمكنك إخباري بالمزيد س: بخصوص التحول من الألبومين البقري المصل (BSA) إلى الألبومين المؤتلف (rAlbumin) في محاليل NEBuffers؟ ج: يسرّ NEB أن تعلن عن استبدال محاليل التفاعل المحتوية على الألبومين البقري المصل (NEBuffer 1.1، 2.1، 3.1 وCutSmart® Buffer) بمحاليل تحتوي على الألبومين المؤتلف (NEBuffer r1.1، r2.1، r3.1 وrCutSmart™ Buffer). كما أننا بصدد تحويل جميع تركيبات إنزيمات التقييد لتشمل الألبومين المؤتلف. ونعتقد أن الابتعاد عن المنتجات الحيوانية خطوة في الاتجاه الصحيح، ونقدم هذا التحسين بنفس السعر. س: هل صبغة تحميل الجل، بنفسجية (6X) أو صبغة تحميل الجل، بنفسجية (6X)، بدون SDS متوافقة مع أصباغ ربط الحمض النووي الأخرى مثل SYBR® وGelRed™ أثناء الفصل الكهربائي الهلامي؟ ج: لأن أصباغ ربط الأحماض النووية عالية الألفة قد تؤثر على هجرة الحمض النووي أثناء يُنصح بشدة بتلوين الهلامات بعد الفصل الكهربائي باستخدام صبغات SYBR أو GelRed. مع ذلك، يمكن استخدام هذه الصبغات أيضًا كصبغات مُدمجة مسبقًا (في هلام الأغاروز). نظرًا لأن صبغة تحميل الهلام، البنفسجية (6X) تحتوي على تركيز أعلى من SDS، فقد تُلاحظ بعض التداخلات عند استخدام SYBR أو GelRed كصبغات مُدمجة مسبقًا. عند استخدام هذه الصبغات كصبغات مُدمجة مسبقًا، توصي NEB باستخدام صبغة تحميل الهلام، البنفسجية، الخالية من SDS (6X) (NEB #B7025S) بدلاً منها. يُرجى اتباع التوصيات التالية لكلا الصبغتين البنفسجيتين عند استخدام صبغات SYBR كصبغات مُدمجة مسبقًا: قلل كمية الحمض النووي المُحمّل إلى 250 إلى 500 نانوغرام، واستخدم 0.5X فقط من صبغات SYBR في الهلامات المُدمجة مسبقًا. هذه الصبغات أكثر حساسية بكثير من EtBr. قد يتسبب التحميل الزائد في ظهور حزم غير واضحة أو مُلطخة. في حال استخدام صبغة تحميل الهلام، البنفسجية (6X) في حالة B7024S، استخدم محلول TBE بدلاً من محلول TAE، حيث يزداد تداخل SDS عند استخدام محلول TAE (في الهلام وكسائل تشغيل). استخدم أصباغ SYBR وفقًا لتوصيات الشركة المصنعة: أضف صبغة SYBR إلى محلول TBE أولاً، ثم أضف مزيج صبغة SYBR\/TBE إلى محلول الأغاروز المنصهر. يُفضل الانتظار بضع دقائق قبل إضافة أصباغ SYBR إلى الأغاروز المنصهر. تُعطي إضافتها إلى محلول أغاروز مُبرد (أعلى من درجة حرارة التجلط، 45 درجة مئوية) نتائج أفضل. قم دائمًا بتشغيل هلام أغاروز مُحضر حديثًا، لمرة واحدة فقط. إعادة تشغيل الهلام ستؤدي إلى نتائج ضعيفة. يُرجى اتباع التوصيات أدناه لكلا الصبغتين البنفسجيتين عند استخدام أصباغ GelRed كأصباغ مُسبقة الصب: قلل كمية الحمض النووي للعينة المُحملة إلى 60 إلى 125 نانوغرام، واستخدم 0.5X فقط من صبغة GelRed في الهلامات مُسبقة الصب. هذه الصبغة أكثر حساسية بكثير من EtBr. قد ينتج تلطخ الشرائط عن التحميل الزائد. يُفضل الانتظار بضع دقائق قبل إضافة صبغة GelRed إلى الأغاروز المنصهر. تُعطي إضافتها إلى محلول أغاروز مُبرد (أعلى من درجة حرارة التجلط، 45 درجة مئوية) نتائج أفضل. استخدم دائمًا هلام أغاروز مُحضر حديثًا، لمرة واحدة فقط. إعادة تشغيل الهلام ستؤدي إلى نتائج رديئة. SYBR® علامة تجارية مسجلة لشركة Life Technologies Corporation، وGelRed™ علامة تجارية لشركة Biotium.","brand":"New England Biolabs","offers":[{"title":"Default Title","offer_id":46835525386409,"sku":"R3195T","price":0.99,"currency_code":"USD","in_stock":true}],"url":"https:\/\/iright.com\/ar\/products\/neb-r3195t","provider":"Iright","version":"1.0","type":"link"}