{"product_id":"neb-e0540s","title":"New England Biolabs, E0540S, paquete de O-glucosidasa y α2-3,6,8-neuraminidasa","description":"Este paquete contiene 1 vial de cada una de O-glucosidasa ( \u003cb\u003eCategorías relacionadas\u003c\/b\u003e Endoglicosidasas \u003cb\u003eAplicaciones\u003c\/b\u003e Sistemas de expresión,, Secuenciación de glicanos,, Digestión de proteínas, \u003cb\u003eEspecificación\u003c\/b\u003e \u003cb\u003eUnidad Definición\u003c\/b\u003e Una unidad de O-glucosidasa se define como la cantidad de enzima necesaria para eliminar 0,68 nmol de disacárido O-ligado de 5 mg de fetuína no desnaturalizada digerida con neuraminidasa en 1 hora a 37 °C en un volumen de reacción total de 100 μl (1 unidad de O-glucosidasa y PNGasa F eliminará cantidades molares equivalentes de disacáridos O-ligados y oligosacáridos N-ligados, respectivamente). No desnaturalizante Unidad Definición de O-glucosidasa: Se añaden diluciones seriadas al doble de O-glucosidasa a una mezcla de reacción de 5 mg de fetuína digerida con neuraminidasa con 1X GlycoBuffer 2. A continuación, la reacción se incuba a 37 °C durante 1 hora. Los carbohidratos disacáridos O-ligados se determinan mediante el ensayo de Morgan y Elson (4). Nota: En condiciones desnaturalizantes, la actividad enzimática se duplica. Esta observación depende del sustrato. Definición de la unidad de neuraminidasa: Una unidad de neuraminidasa se define como la cantidad de enzima necesaria para escindir \u0026gt; 95 % del α-Neu5Ac terminal de 1 nmol de Neu5Acα2-3Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc-7-amino-4-metil-cumarina (AMC), en 5 minutos a 37 °C en un volumen total de reacción de 10 μl. 1X Tampón desnaturalizante de glicoproteínas 0,5 % SDS 40 mM DTT 1X NP-40 1 % NP-40 en MilliQ-H₂O. \u003cb\u003eCondiciones de reacción:\u003c\/b\u003e 1X Tampón de glicoproteína 2. Incubar a 37 °C con tampón de glicoproteína 1X 2, fosfato de sodio 50 mM (pH 7,5 a 25 °C). \u003cb\u003ePreguntas frecuentes\u003c\/b\u003e : P: ¿Cuáles son las condiciones de reacción típicas para la O-glicosidasa? R: Los tiempos de incubación óptimos y las concentraciones enzimáticas deben determinarse empíricamente para un sustrato específico. Las condiciones de reacción típicas son las siguientes: combinar de 10 a 20 µg de glicoproteína, 1 µl de tampón desnaturalizante de glicoproteína 10X y H₂O (si es necesario) para obtener un volumen total de reacción de 10 µl. Desnaturalizar la glicoproteína calentando la reacción a 100 °C durante 10 minutos. Obtener un volumen total de reacción de 20 µl añadiendo 2 µl de tampón de glicoproteína 10X 2, 2 µl de NP-40 al 10 %, 2 µl de neuraminidasa, H₂O y de 1 a 5 µl. O-glicosidasa. Incubar la reacción a 37 °C durante 1 a 4 horas. Nota: La O-glicosidasa puede utilizarse tanto en condiciones desnaturalizantes como nativas. Sin embargo, en condiciones desnaturalizantes, la actividad enzimática se duplica. Esta observación depende del sustrato. La reacción puede aumentarse linealmente para acomodar grandes cantidades de O-glicosidasa y volúmenes de reacción mayores. P: ¿Es necesario tratar mi glucoproteína simultáneamente con neuraminidasa y O-glicosidasa? R: Sí. Los residuos de ácido neuramínico deben eliminarse para que la O-glicosidasa escinda los disacáridos O-ligados. Una neuraminidasa general (NEB n.° P0720) funciona bien. Además, está disponible un paquete de O-glicosidasa y neuraminidasa (NEB n.° E0540S). P: ¿Cuál es la diferencia entre PNGasa F, Endo H y O-glicosidasa? R: PNGasa F Elimina todos los tipos de glicosilación ligada a N (ligada a Asn): alta manosa, híbrida, bi, tri y tetraantenaria. Esta enzima se debe elegir si el objetivo es eliminar todos los carbohidratos ligados a N sin importar el tipo. Endo H elimina solo la alta manosa y algunos tipos híbridos de carbohidratos ligados a N. Se debe elegir esta enzima para determinar con mayor precisión el tipo de glicosilación ligada a N o si se sabe que la proteína tiene un carbohidrato sensible a Endo H. La O-glucosidasa de NEB eliminará los disacáridos desializados de los núcleos 1 y 3 ligados a O unidos a residuos de Ser\/Thr. P: ¿Cuánta O-glucosidasa debo usar para eliminar mi carbohidrato en condiciones nativas? R: Cuando la proteína no está desnaturalizada, la O-glucosidasa puede tener dificultades para alcanzar el sitio de escisión del carbohidrato (debido a la estructura secundaria y terciaria de la proteína). En ocasiones, una enzima adicional y tiempos de incubación prolongados pueden ser útiles, pero estos valores son específicos. A cada proteína y debe determinarse empíricamente. P: ¿Cómo inhibo la O-glucosidasa? R: El SDS inhibe la O-glucosidasa. P: ¿Cuál es un buen control positivo para la O-glucosidasa? R: Sugerimos p-nitrofenil galacto-N-biósido (Galβ1-3GalNAcα1pNP o Core1-pNP). Como alternativa, la fetuína (NEB n.° P6042S) puede digerirse con neuraminidasa, y neuraminidasa más O-glucosidasa. Los cambios en el peso molecular de la fetuína tras la eliminación de glicanos se pueden observar mediante SDS-PAGE. P: ¿Por qué las enzimas NEB glicosidasas han cambiado de tampón de reacción? ¿Cuáles son los nuevos tampones de reacción? ¿Puedo seguir utilizando una enzima con su tampón anterior? ¿Dónde puedo encontrar la composición de los tampones anteriores? R: Para simplificar los flujos de trabajo y las digestiones con dos o más exoglucosidasas, la mayoría de las enzimas ahora se suministran con 10X GlycoBuffer 1. Se incluyen dos excepciones con GlycoBuffer 4. Además, se ha simplificado el panel de tampones para endoglicosidasas. Se evaluó la actividad de cada enzima endo y exoglicosidasa tanto en su sistema de tampón antiguo como en el nuevo. Todas las enzimas conservaron la misma actividad o mostraron una mayor actividad en el nuevo tampón. Algunas exoglicosidasas se suministran con un vial adicional de rHSA (la rHSA potencia la actividad de ciertas enzimas). Como antes, algunas exoglicosidasas se suministran con un vial adicional de BSA (la BSA potencia la actividad de ciertas enzimas). Otros componentes (como el tampón desnaturalizante de glicoproteínas, NP-40, etc.) se suministran cuando se requieren. Enzima Producto n.° Tampón antiguo Tampón actual ¿Cambió? α-N-Acetilgalactosaminidasa P0734 G7 GlycoBuffer 1 SÍ α1-2 Fucosidasa P0724 G4 GlycoBuffer 1 SÍ α1-2,3,4,6 Fucosidasa P0748 --- GlycoBuffer 1 --- α1-2,4,6 Fucosidasa O p0749 --- GlycoBuffer 1 --- α1-3,4 Fucosidasa p0769 --- GlycoBuffer 1 --- α1-2,3 Manosidasa P0729 G6 GlycoBuffer 1 no α1-6 Manosidasa P0727 G2 GlycoBuffer 1 SÍ α1-2,3,6 Manosidasa p0768 --- GlycoBuffer 4 --- α1-3,4,6 Galactosidasa P0747 --- GlycoBuffer 1 ---- α1-3,6 Galactosidasa P0731 G6 GlycoBuffer 1 no α2-3 Neuraminidasa S P0743 --- GlycoBuffer 1 --- α2-3,6,8 Neuraminidasa P0720 G1 GlycoBuffer 1 SÍ α2-3,6,8,9 Neuraminidasa A P0722 --- GlycoBuffer 1 --- β-N-Acetilhexosaminidasef P0721 G2 GlycoBuffer 1 SÍ β-N-Acetilglucosaminidasa P0732 G1 GlycoBuffer 1 SÍ β-N-Acetilglucosaminidasa S P0744 --- GlycoBuffer 1 --- β1-3 Galactosidasa P0726 G6 GlycoBuffer 1 no β1-4 Galactosidasa S P0745 --- GlycoBuffer 1 --- β1-3,4 Galactosidasa p0746 --- GlycoBuffer 4 --- Kit de secuenciación de N-glicanos E0577 --- GlycoBuffer 1 --- Endo S P0741 G6 GlycoBuffer 1 SÍ Endo H P0702 G5 GlycoBuffer 3 SÍ Endo Hf P0703 G5 GlycoBuffer 3 SÍ Endo F2 p0772 --- GlycoBuffer 4 --- Endo F3 p0771 --- GlycoBuffer 4 --- Endo D P0742 G7 GlycoBuffer 2 sin O-glicosidasa P0733 G7 GlycoBuffer 2 sin O-glicosidasa y neuraminidasa Bundle E0540 G7 GlycoBuffer 2 sin Remove-iT® PNGase F P0706 G7 GlycoBuffer 2 sin PNGase F P0704 G7 GlycoBuffer 2 sin PNGase F (sin glicerol) P0705 G7 GlycoBuffer 2 sin PNGase F, recombinante P0708 G7 GlycoBuffer 2 sin PNGase F (Sin glicerol), recombinante P0709 G7 GlycoBuffer 2 sin PNGasa A p0707 --- Glyco Buffer 3 --- Protein Deglycosylation Mix II p6044 --- Deglycosylation Mix Buffer 1 y 2 --- Rapid PNGase F P0710 --- Rapid PNGase F Buffer ---- Rapid™ PNGase F (formato no reductor) p0711 --- Rapid PNGase F (formato no reductor) Buffer P: ¿Los detergentes inhiben la O-glicosidasa? R: Es imperativo agregar NP-40 a una concentración final del 1% a su mezcla de reacción para contrarrestar la inhibición del detergente. La O-glicosidasa tiene actividad completa en presencia de 1% de NP-40. P: Intenté usar O-glicosidasa en mi glicoproteína y no vi la eliminación del carbohidrato. ¿Cuál podría ser el problema? R: ¿Sabe cómo se une el carbohidrato a la proteína? ¿Es N-, o ¿Enlazado a O (ligado a una Asn o a una Ser\/Thr)? La PNGasa F solo elimina los carbohidratos unidos a una Asn. La O-glucosidasa elimina los disacáridos O-ligados del núcleo 1 y del núcleo 3 unidos a Ser\/Thr. Si está seguro de que tiene carbohidratos O-ligados, asegúrese de tratar su glucoproteína con neuraminidasa y desnaturalizarla antes de la desglicosilación. La estructura secundaria y terciaria de las proteínas puede impedir que las endoglicosidasas alcancen su sustrato, lo que convierte la desnaturalización en un paso crucial para una escisión eficiente. Si no desea desnaturalizar, considere añadir más enzima y tiempos de incubación más largos. Si ha desnaturalizado la proteína, asegúrese de añadir NP-40 (para proteger la O-glucosidasa del SDS en el paso de desnaturalización).","brand":"New England Biolabs","offers":[{"title":"Default Title","offer_id":46835501760681,"sku":"E0540S","price":0.99,"currency_code":"USD","in_stock":true}],"url":"https:\/\/iright.com\/es\/products\/neb-e0540s","provider":"Iright","version":"1.0","type":"link"}