{"product_id":"neb-e2019s","title":"New England Biolabs, E2019S, kit de ensayo colorimétrico rápido LAMP para SARS-CoV-2","description":"El kit de ensayo LAMP colorimétrico rápido SARS-CoV-2 utiliza amplificación isotérmica para su uso en el análisis del SARS-CoV-2, el nuevo coronavirus que causa la COVID-19. \u003cb\u003eCategorías relacionadas\u003c\/b\u003e Amplificación isotérmica y desplazamiento de cadena, PCR, qPCR y tecnologías de amplificación \u003cb\u003eAplicaciones\u003c\/b\u003e Amplificación isotérmica mediada por bucle, amplificación isotérmica, amplificación de ADN, PCR y qPCR \u003cb\u003eEspecificación\u003c\/b\u003e \u003cb\u003eMateriales necesarios pero no suministrados\u003c\/b\u003e Guantes desechables sin polvo y cualquier EPP adicional requerido Puntas de barrera de aerosol P2\/P10, P200 y P1000 Tubos de microcentrífuga estériles y sin nucleasas de 1,5 ml Tubos estériles y sin nucleasas de 2,0 ml, 5,0 ml o 15 ml Tiras de tubos de reacción de PCR de 0,2 ml con tubos y tapas separados (p. ej., VWR 20170-004) o tapas adjuntas (p. ej., VWR 20170-010) o placas de reacción de PCR de 96 pocillos con tiras de 8 tapas Gradillas para tubos de microcentrífuga de 1,5 ml y tubos de reacción de PCR de 96 pocillos de 0,2 ml Tubos Gradilla para enfriador de tubos de microcentrífuga de 1,5 y tubos de reacción de PCR de 96 pocillos de 0,2 ml Descontaminantes de superficie aceptables, por ejemplo: 10% de lejía (dilución 1:10 de hipoclorito de sodio comercial al 5,25-6,0%) Marcador de laboratorio Contenedores de eliminación apropiados Papel blanco o fondo claro para una visualización óptima de la reacción colorimétrica (p. ej., papel de impresora típico) Micropipetas (2 o 10 μl, 200 μl y 1000 μl), micropipetas multicanal (5-50 μl) Congelador de -20 °C (con o sin escarcha), refrigerador de 4 °C Termociclador, bloque de calor o dispositivo que se pueda configurar a 65 °C Estación de trabajo de PCR [lámpara UV; Flujo laminar (filtrado HEPA clase 100), mezclador vórtex, microcentrífuga de sobremesa \u003cb\u003ePreguntas frecuentes\u003c\/b\u003e P: ¿Cómo afecta la nueva variante de Omicron a la eficacia del kit de ensayo LAMP colorimétrico rápido para SARS-CoV-2? R: El kit de ensayo LAMP colorimétrico rápido para SARS-CoV-2 es un ensayo isotérmico que se dirige a las regiones de los genes N y E del genoma viral del SARS-CoV-2. Los cebadores para ambas regiones diana están presentes en la misma reacción, por lo que la amplificación de cualquiera de los dos puede generar una señal positiva. La nueva variante de la COVID-19, Omicron, contiene una mutación puntual en una región del gen E que es la diana de los cebadores LAMP de este kit. Dada la posición de esta mutación y la tolerancia general de LAMP a las mutaciones puntuales, no prevemos un impacto significativo en el rendimiento del ensayo con la variante Omicron (B.1.1.529). Para evaluar esto experimentalmente, se realizó una prueba directa de ARN IVT que representa las plantillas de genes E del SARS-CoV-2 de tipo salvaje (Wuhan) y mutante (Omicron) en presencia de ARN del gen N de tipo salvaje, y se observaron resultados sustancialmente equivalentes en un rango de 3 logaritmos de entradas. Con una entrada baja (50 copias\/reacción), se observó una detección del 100 % de ambas muestras (36\/36 réplicas analizadas). Nota de aplicación relacionada: Detección de la mutación de la variante Omicron en la posición 26 270 del gen E del SARS-CoV-2 mediante el kit de ensayo LAMP colorimétrico rápido para SARS-CoV-2 P: ¿Se puede utilizar la mezcla maestra colorimétrica LAMP 2X en instrumentos que utilizan la detección fluorescente de la amplificación del ADN o la medición de la turbidez en tiempo real? R: La mezcla maestra es compatible con los métodos de detección fluorescente cuando se complementa con colorantes fluorescentes que intercalan el ADN y proporciona una velocidad de reacción similar a la LAMP convencional. También es posible realizar la detección LAMP en un turbidímetro en tiempo real, aunque su velocidad de reacción es ligeramente inferior a la de un LAMP convencional. P: ¿Qué tan estables son las mezclas maestras colorimétricas WarmStart LAMP 2X? R: Las mezclas maestras colorimétricas LAMP son estables en condiciones de uso y manipulación estándar. Contienen una baja concentración de Tris pH 8 y el rojo de fenol, sensible al pH, muestra un color rosa brillante cerca de este pH. Tras el uso repetido del mismo tubo, es posible que se produzca una ligera disminución del pH, pero normalmente no afectará al rendimiento de la reacción, siempre que la mezcla siga siendo rosada antes de la amplificación. Ocasionalmente, tras múltiples usos y una exposición prolongada al aire, el pH puede descender por debajo de pH 7 y la mezcla adquirirá un color naranja claro a amarillo antes de su uso. Este cambio de color indica visualmente que la solución ya no es adecuada para la reacción LAMP colorimétrica. Por lo tanto, se recomienda evitar la exposición prolongada al aire cerrando las tapas de los tubos y almacenando la mezcla maestra en el vial que la contenía (o en viales similares con juntas tóricas) a -20 °C. Si la mezcla maestra se pipetea en tubos de tira, tubos de PCR o similares, recomendamos usar el material dentro del mismo día. P: La mezcla maestra WarmStart LAMP tiene algo de precipitación en el tubo después de la descongelación, ¿es esto normal? R: Sí, la precipitación de las mezclas maestras LAMP después de la congelación\/descongelación es normal. Es importante resuspender la mezcla mezclándola bien o agitándola en vórtex para disolver todo el material precipitado, pero después de la suspensión las mezclas maestras se pueden usar normalmente. P: ¿Qué pasa si mi mezcla LAMP colorimétrica es naranja en lugar de rosa antes de la amplificación? R: Las mezclas LAMP colorimétricas son estables en condiciones estándar de manipulación y uso. Contienen una baja concentración de Tris pH 8 y el rojo fenol sensible al pH muestra un color rosa brillante cerca de este pH. Después del uso repetido del mismo tubo, es posible una ligera caída del pH, pero generalmente no afectará el rendimiento de la reacción siempre que la mezcla todavía sea rosa antes de la amplificación. Ocasionalmente, después de múltiples usos y una exposición prolongada al aire, el pH puede descender por debajo de 7 y la mezcla adquirirá un color naranja claro a amarillo antes de su uso. Este cambio de color indica visualmente que la solución ya no es apta para la reacción colorimétrica LAMP. Por lo tanto, se recomienda evitar la exposición prolongada al aire cerrando las tapas de los tubos y almacenando la mezcla maestra en el vial que la contenía (o en viales similares con juntas tóricas) a -20 °C. Si la mezcla maestra se pipetea en tubos de tira, tubos de PCR o similares, recomendamos utilizar el material el mismo día. P: ¿La mezcla maestra colorimétrica LAMP WarmStart® con UDG permite prevenir el arrastre\/reducir la contaminación? R: Sí, la mezcla maestra colorimétrica LAMP WarmStart® con UDG está formulada con una mezcla de dTTP y dUTP. Esto garantiza tanto una amplificación isotérmica eficiente como la incorporación de dU en los productos de reacción. La mezcla también contiene UDG termolábil antártico (NEB n.° M0372). Los productos LAMP que contienen dU sirven como sustrato para la uracilo ADN glicosilasa, lo que permite prevenir la contaminación por arrastre. Las reacciones deben configurarse a temperatura ambiente (normalmente 22-25 °C) antes de la incubación isotérmica a 65 °C para permitir la degradación de los amplicones que contienen dU o, si se desea, una incubación de 10 minutos a 25 °C antes de poder añadir LAMP al flujo de trabajo. Dado que LAMP puede generar grandes cantidades de ADN en periodos muy cortos, las mejores prácticas para reducir la contaminación consisten en no abrir las reacciones LAMP después de la amplificación. P: ¿Afecta el precalentamiento del bloque térmico a las reacciones de amplificación LAMP? R: Sí, hemos observado que colocar las reacciones LAMP en un bloque térmico precalentado a 65 °C (en lugar de dejar que las muestras alcancen los 65 °C a medida que el bloque se calienta) tiende a mejorar específicamente la detección de muestras con un bajo aporte. P: ¿A qué regiones del virus SARS-CoV-2 se dirigen los cebadores LAMP? ¿Cómo se eligieron estos cebadores? R: La mezcla de cebadores LAMP para SARS-CoV-2 es una mezcla de dos conjuntos de cebadores; un conjunto se dirige al gen N y el segundo conjunto se dirige al gen E. Los conjuntos de cebadores funcionan bien individualmente, pero mezclarlos mejora la sensibilidad de detección. P: En el kit de ensayo LAMP colorimétrico rápido para SARS-CoV-2, ¿cuál es el objetivo de la mezcla de cebadores de control interno (rActin)? R: La mezcla de cebadores LAMP de control interno se dirige al ARN de actina en una unión exón-exón. Los cebadores también incluyen una región que coincide con una secuencia de anquirina en el ADNg, por lo que se pueden observar bajos niveles de amplificación del ADNg de mamíferos, pero esta es una contribución menor a la señal general, dado que el ARN de rActin suele estar presente en un número de copias mucho mayor que el ADNg. P: ¿Debo usar clorhidrato de guanidina (B2619A) en reacciones LAMP colorimétricas? R: Recomendamos que las reacciones LAMP colorimétricas contengan una concentración final de 40 mM de clorhidrato de guanidina y, en consecuencia, proporcionarla para su adición a la reacción LAMP en el flujo de trabajo estándar del SARS-CoV-2. Sin embargo, algunos flujos de trabajo de preparación de muestras aguas arriba pueden introducir una fuente de guanidina en la muestra que puede transportarse a la reacción LAMP. Si la guanidina se transportará a la reacción con el material de entrada, recomendamos no exceder los 60 mM en la reacción final y reemplazar el volumen asignado para guanidina HCl con agua libre de nucleasas. La guanidina mejora la amplificación isotérmica, produciendo una detección más rápida del ARN del SARS-CoV-2. La LAMP colorimétrica se llevó a cabo utilizando muestras positivas purificadas (10 ng\/ul de ARN total humano + ARN sintético del SARS-CoV-2 a 10.000 copias por reacción). Se utilizaron los conjuntos de cebadores E1 o N2 del kit de ensayo LAMP colorimétrico rápido SARS-CoV-2 como se indica, y la amplificación se monitoreó en tiempo real utilizando un tinte fluorescente. Para ambos conjuntos de cebadores, la adición de guanidina HCl a una concentración final de 40-60 mM mejoró la amplificación, lo que resultó en una detección más temprana y un cambio de color mejorado. P: ¿Cómo se interpretan los resultados colorimétricos de LAMP en el kit SARS-CoV-2? R: Las reacciones colorimétricas de LAMP cambiarán de rosa a amarillo si se produce amplificación. Las reacciones del control interno (rActin) y del control positivo de SARS-CoV-2 deben ser amarillas y el NTC debe ser rosa para que los resultados de la prueba sean precisos. Consulte el manual del producto para obtener instrucciones más detalladas sobre la interpretación de los resultados. P: Después de la amplificación, mis muestras se volvieron naranjas en lugar de amarillas. ¿Es esto aceptable? ¿Cómo interpreto los resultados? R: Un color naranja después de la incubación a 65 °C durante 30 minutos sugiere que se produjo la amplificación, pero el pH no disminuyó lo suficiente como para que la reacción se volviera amarilla. Esto puede deberse a la inhibición de la muestra de entrada, al tampón de la muestra de entrada o indica que la muestra contiene una cantidad baja de ácido nucleico diana. Puede interpretarse como positivo si todas las muestras eran rosas antes de la amplificación y, después de la amplificación, las reacciones de IC y PC son amarillas\/naranjas y el NTC es rosa. P: ¿Puedo incubar mis muestras colorimétricas LAMP Sars-CoV-2 más de 30 minutos a 65 °C? ¿Cuánto tiempo debo incubar la reacción antes de verificar los resultados? R: Nuestro tiempo de incubación recomendado para las reacciones LAMP es de 30 min. Con este tiempo, la mayoría de las reacciones LAMP que contienen ácido nucleico diana se completarán sin amplificación en el control sin molde. Para muestras con un alto número de copias, tiempos de incubación tan cortos como 15 minutos pueden resultar en la detección. Las muestras con bajo aporte o que contienen inhibidores pueden requerir tiempos de incubación más largos a 65 °C para visualizar la detección, aunque esto puede aumentar la probabilidad de resultados falsos positivos. Por lo general, no recomendamos tiempos de incubación superiores a 40 minutos para este flujo de trabajo. P: Mi(s) muestra(s) NTC se volvieron naranja\/amarillas después de la incubación a 65 °C. ¿Qué sucedió? R: Si el control sin molde se vuelve naranja o amarillo después de la incubación, los resultados del ensayo no son válidos y pueden indicar contaminación cruzada durante la configuración de la reacción, posiblemente del control positivo de SARS-CoV-2. Si la reacción de NTC cambia de color al repetir la prueba, reemplace todas las existencias de reactivos y limpie el espacio de trabajo con un descontaminante de superficie aceptable, como lejía al 10 % (dilución 1:10 de hipoclorito de sodio comercial al 5,25-6,0 %). P: Mi control positivo colorimétrico LAMP SARS-CoV-2 no se volvió amarillo después de la incubación a 65 °C. ¿Qué sucedió? R: La reacción del control positivo siempre debe volverse amarilla después de la incubación a 65 °C. Si no cambia de color, indica un error en la configuración de la reacción. Repita la configuración del ensayo. Si esto continúa sucediendo, comuníquese con el soporte técnico de NEB en info@neb.com o a través de su contacto local de NEB. P: ¿Qué es el control positivo de SARS-CoV-2 incluido en el kit? R: El control positivo de SARS-CoV-2 (N2117) es un plásmido que contiene el gen N de SARS-CoV-2 (GenBank: MN908947.3). La concentración a 12,5X es de aproximadamente 1 000 000 de copias\/µL y cada lote se evalúa mediante qPCR. Tenga en cuenta que no recomendamos el uso de la concentración del control positivo como número absoluto de copias para experimentos cuantitativos. P: ¿Cuánta muestra se puede añadir a la reacción colorimétrica LAMP como entrada? R: Para obtener los mejores resultados, recomendamos 2 µl de ácido nucleico extraído en una reacción de 25 µl. Se pueden tolerar volúmenes de muestra mayores o menores. Asegúrese de que el ácido nucleico se eluya o se prepare en agua para evitar arrastrar el exceso de tampón a la reacción. El material eluido en TE o un tampón de elución similar debe mantenerse a menos de 5 µl (20 % v\/v) del volumen final de la reacción. Las muestras en medios de transporte (VTM o UTM) deben mantenerse a menos de 2 µl (8 % v\/v). Para aumentar el volumen de la muestra, utilice tampón de elución 0,1X o agua para la preparación del ácido nucleico. P: ¿Qué tipos de muestras\/materiales son compatibles con el kit de ensayo LAMP colorimétrico rápido para SARS-CoV-2? R: Para obtener los mejores resultados, recomendamos usar ácido nucleico extraído. Dado que las reacciones LAMP colorimétricas cambian de color según el cambio de pH durante la amplificación, el ácido nucleico debe eluirse o prepararse en agua para evitar el arrastre de un exceso de tampón a la reacción. El material eluido en TE o un tampón de elución similar debe mantenerse a menos de 5 μl (20 % v\/v) del volumen final de la reacción. Se puede usar hasta 1 µl (4 % v\/v) de medio de transporte (UTM o VTM) sin afectar la reacción colorimétrica. Para aumentar el volumen de la muestra, utilice tampón de elución 0,1X o agua para la preparación del ácido nucleico. Tenga en cuenta que el SDS no suele tolerarse bien en las reacciones LAMP colorimétricas y que los compuestos de guanidina (clorhidrato, isotiocianato) deben mantenerse a menos de 60 mM en la reacción final. Se desarrollan continuamente métodos de preparación de muestras simples o rudimentarios, algunos de los cuales también son compatibles con LAMP colorimétrico. MedRXiv y BioRXiv son excelentes recursos para obtener las opciones más actualizadas en materia de preparación de muestras. Puede encontrar una selección de prepublicaciones que describen diferentes tipos de muestras y su utilidad con LAMP colorimétrico en la página de Amplificación Isotérmica, RT-qPCR y COVID-19. P: Mi muestra de SARS-CoV-2 o la reacción de control interno se tornaron naranja\/amarillas al añadir la muestra. ¿Significa eso que la muestra contiene ácido nucleico? R: Un cambio de color a amarillo o naranja al añadir ácido nucleico de muestra para las reacciones de control interno o de muestra de prueba de SARS-CoV-2 indica que el material de entrada es incompatible con el ensayo y los resultados no son válidos. No debe interpretarse como la presencia de ácido nucleico diana. Repita el proceso con un volumen de muestra menor o ajuste el pH de entrada de la muestra a ~ 8. Si las reacciones de NTC o PC se tornan amarillas o naranjas inmediatamente después de la configuración, repita la configuración del ensayo. P: ¿Qué instrumentos son compatibles con el kit de ensayo LAMP colorimétrico rápido para SARS-CoV-2? R: El LAMP colorimétrico es compatible con diversos instrumentos que proporcionan calentamiento a 65 °C, incluyendo termocicladores estándar, instrumentos de qPCR, calentadores de placas y bloques térmicos. Si se desea, se pueden utilizar métodos con agua caliente o sin instrumentación. El rendimiento del kit LAMP colorimétrico para SARS-CoV-2 se ha evaluado en los siguientes instrumentos y funciona bien en condiciones estándar a menos que se indique lo contrario: ABI 2720 ABI Veritti ABI MiniAmp ABI SimpliAmp ABI 7500 ABI StepOnePlus ABI 7500 ABI QuantStudio 6 Flex Bio-Rad T100 Bio-Rad CFX Connect Bio-Rad CFX96 Bio-Rad Tetrad 2 Bio-Rad C1000 Bio-Rad S1000 Douglas\/Agdia Amplifire Axxin T8 Iso (siga las recomendaciones para la mezcla de muestras) MiniPCR: Mini16 VWR Digital Heat Block Eppendorf ThermoMixer CQ: ¿Puedo monitorear el cambio de color de las reacciones LAMP colorimétricas usando un espectrofotómetro? R: Sí. La reacción se puede monitorear en tiempo real o en el punto final como parte de un flujo de trabajo de alto rendimiento midiendo la relación de absorbancia de 432 nm\/560 nm. P: ¿Se pueden utilizar las mezclas maestras colorimétricas WarmStart LAMP 2X en instrumentos que utilizan detección de fluorescencia? R: La mezcla maestra colorimétrica es compatible con los métodos de detección de fluorescencia cuando se complementa con colorantes fluorescentes intercalantes de ADN (SYTO 9 o similar) y proporciona velocidades de reacción similares a las de las LAMP convencionales. Sin embargo, recomendamos utilizar nuestros productos LAMP estándar (NEB n.° E1700, E1708) cuando la lectura principal sea la fluorescencia.","brand":"New England Biolabs","offers":[{"title":"Default Title","offer_id":46835511918761,"sku":"E2019S","price":0.99,"currency_code":"USD","in_stock":true}],"url":"https:\/\/iright.com\/es\/products\/neb-e2019s","provider":"Iright","version":"1.0","type":"link"}