{"product_id":"neb-e3322v","title":"New England Biolabs, E3322V, kit de síntesis de ARNsg EnGen®, S. pyogenes","description":"El kit de síntesis de sgRNA de EnGen, \u003cb\u003ecategorías relacionadas\u003c\/b\u003e \u003cb\u003eEspecificación\u003c\/b\u003e de síntesis de sgRNA \u003cb\u003eMateriales necesarios pero no suministrados\u003c\/b\u003e Oligonucleótidos de ADN específicos del objetivo Termociclador\/bloque térmico de 37 °C\/incubadora Agua sin nucleasas Equipos y reactivos para cuantificación de ARN Columnas de centrifugación para limpieza de ARN (p. ej., NEB n.º T2040) Tubos sin ARNasa, puntas de aerosol Microcentrífuga Materiales opcionales: fosfatasa alcalina, nucleasa Cas9 de intestino delgado (CIP), S. pyogenes EnGen Spy Cas9, geles NLS, tampón de ejecución, colorante de carga de gel, escaleras de ARN y ADN, caja de gel \u003cb\u003ePreguntas frecuentes\u003c\/b\u003e P: ¿Es necesario añadir una \"G\" al oligonucleótido que sigue a la secuencia del promotor T7? R: Para una transcripción eficiente se requiere al menos una G, directamente aguas abajo de la \"TATA\" de la secuencia del promotor T7. Esta G será el +1 de la transcripción. Si la secuencia específica del objetivo de 20 nucleótidos seleccionada tiene una G en el extremo 5' de los 20 nucleótidos, entonces no es necesario agregar una G adicional ya que la G dentro de la secuencia específica del objetivo servirá como el +1. P: ¿Es necesario tratar con ADNasa mi reacción de síntesis de ARNsg? R: Recomendamos tratar con ADNasa la reacción de síntesis de ARNsg con 2 µl de la ADNasa I proporcionada (sin ARNasa) durante 15 minutos a 37 °C, seguido de una purificación en columna de centrifugación. La eliminación del molde de ADN y los NTP y dNTP sobrantes dará como resultado una medición más confiable del rendimiento de ARN, ya que los instrumentos que leen A260 (como un espectrofotómetro UV tradicional o NanoDrop™) leerán tanto ARN como ADN y no darán una concentración confiable. Es importante considerar cómo el molde sobrante, los dNTP y los NTP pueden afectar las aplicaciones posteriores. P: ¿Por qué mi sgRNA no muestra una actividad de escisión de Cas9 del 100 % in vitro? R: Recomendamos usar sitios web de predicción de dianas para identificar las secuencias óptimas para la segmentación génica mediante Cas9. Consulte la página del producto Cas9 (NEB n.° M0386 o NEB n.° M0641 (NLS)) para obtener información sobre el protocolo. Para obtener información general sobre la edición genómica y la planificación de experimentos con productos NEB, consulte: https:\/\/www.neb.com\/applications\/cloning-and-synthetic-biology\/genome-editing. P: ¿Es necesario tratar mis sgRNA con fosfatasa? R: Los ARN transcritos con una polimerasa de bacteriófagos poseen trifosfatos 5'. El tratamiento con fosfatasa eliminará estos trifosfatos, dejando un 5' OH. Si se trata con fosfatasa, recomendamos el tratamiento después del tratamiento con DNasa I. La enzima no puede inactivarse con calor, por lo tanto, la extracción con fenol:cloroformo es el método preferido para inactivar la enzima. P: ¿Los sgRNA sintetizados a partir de este kit (NEB #E3322S) serán reconocidos por homólogos de Cas9 de diferentes organismos? R: No. Los sgRNA sintetizados a partir de este kit contienen la secuencia tracrRNA que es específicamente reconocida por Cas9 de S. pyogenes P: ¿Incluyo el PAM(NGG) en mi secuencia de sgRNA? R: Cuando Cas9 se une al sgRNA, se forma un complejo que luego se dirige para unirse al ADN diana cuando un sitio PAM(NGG) está presente directamente aguas abajo de la secuencia diana de 20 nt en el ADN. El PAM es necesario que esté presente en la cadena diana para que el complejo Cas9 reconozca y se una al ADN. No es parte de la secuencia de ARN guía y no debe incluirse en el oligo al diseñar sgRNA. P: ¿Cuál es la secuencia del oligonucleótido de control incluido en el kit de síntesis de ARNsg de EnGen para S. pyogenes? R: La secuencia del oligonucleótido de control es: 5' TTCTAATACGACTCACTATAGGCATCCTCGGCACCGTCACCCGTTTTAGAGCTAGA 3' La secuencia final del ARNsg de control sintetizado con el kit sería: GGCAUCCUCGGCACCGUCACCCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU. El ARNsg sintetizado a partir del oligonucleótido de control se dirige a pBR322 (NEB n.° N3033, bases 112-131). La secuencia completa del plásmido se puede encontrar aquí. La incubación del sgRNA de control complejado con Cas9 de S. pyogenes en presencia del plásmido pBR322 linealizado con PvuII como diana (4361 pb) da como resultado productos de escisión de 2423 y 1938 pb (véase la Figura 6 del manual). Alternativamente, se puede utilizar un plásmido sin cortar (superenrollado) como plantilla. En un gel de agarosa, en comparación con la plantilla sin cortar, el plásmido cortado por Cas9 migrará más lentamente (correrá más alto) que el plásmido superenrollado. La secuencia diana para el sgRNA de control es: 5' CATCCTCGGCACCGTCACCC 3' Esta secuencia está dentro del gen tetR(C) en el plásmido pBR322 y puede estar presente en otros vectores de clonación, aunque la secuencia exacta en la diana debe verificarse, ya que tetR puede estar en la orientación opuesta o puede contener la secuencia de otra clase de genes tetR. P: ¿Es compatible el kit de limpieza de ARN Monarch Spin (NEB n.° T2040) con el kit de síntesis de ARNsg de EnGen para S. pyogenes? R: Sí, los ARNsg sintetizados con el kit de síntesis de ARNsg de EnGen para S. pyogenes (NEB n.° E3322) pueden limpiarse con el kit de limpieza de ARN Monarch Spin (50 µg, NEB n.° T2040) antes de la formación de complejos de ribonucleoproteína (RNP) y su posterior electroporación en células. P: ¿Es necesario añadir el DTT incluido a la reacción de síntesis de ARNsg? R: Sí. Hemos incluido un vial de DTT 0,1 M, ya que consideramos que proporciona un rendimiento y una producción de ARN más consistentes. Consulte el protocolo y el manual actualizados.","brand":"New England Biolabs","offers":[{"title":"Default Title","offer_id":46835515195561,"sku":"E3322V","price":0.99,"currency_code":"USD","in_stock":true}],"url":"https:\/\/iright.com\/es\/products\/neb-e3322v","provider":"Iright","version":"1.0","type":"link"}