{"product_id":"neb-e3365s","title":"New England Biolabs, E3365S, módulo de conversión enzimática de 5hmC-seq NEBNext®","description":"\u003cb\u003eCategorías relacionadas con\u003c\/b\u003e NEBNext Detección y análisis de hidroximetilación, Análisis de metilomas, Análisis de metilación de ADN, \u003cb\u003eEspecificación\u003c\/b\u003e \u003cb\u003eMateriales necesarios pero no suministrados\u003c\/b\u003e Si el ADN requiere fragmentación: NEBNext UltraShear™ (NEB #M7634) o instrumento Covaris® y los tubos necesarios u otro equipo de fragmentación Tubos de tiras de PCR o placas de 96 pocillos Perlas de limpieza: Kit de reactivos SPRIselect™ (Beckman Coulter®, Inc. #B23317), perlas AMPure® XP (Beckman Coulter, Inc. #A63881) o fabricante de perlas preferido. Formamida (Sigma #F9037-100 ml), formamida Hi-Di™ (Thermo Fisher Scientific® #4401457) o NaOH 0,1 N. Se prefiere la formamida. Si usa NaOH, consulte las preguntas frecuentes en la página de preguntas frecuentes de NEB #E3365. 80% Etanol 1X TE (10 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM EDTA), TE bajo (10 mM Tris-HCl pH 8,0, 0,1 mM EDTA) o 10 mM Tris-HCl pH 7,5 u 8,0 Agua libre de nucleasas Soporte\/gradilla magnética, como NEBNext Magnetic Separation Rack (NEB #S1515) Bloque de enfriamiento metálico, como Diversified Biotech® (#CHAM-1000) Máquina de PCR Agilent® Bioanalyzer®, TapeStation® u otro analizador de fragmentos y consumibles asociados \u003cb\u003ePreguntas frecuentes\u003c\/b\u003e P: ¿Qué tipos de muestras se pueden procesar utilizando el kit NEBNext® Enzymatic 5hmC-seq (NEB #E3350) y el módulo de conversión NEBNext Enzymatic 5hmC-seq (NEB #E3365)? R: NEBNext Enzymatic 5hmC-seq se puede usar con ADN genómico, ADN libre de células y ADN FFPE. P: ¿Cuáles son los insumos recomendados para el kit NEBNext® Enzymatic 5hmC-seq (NEB #E3350) y el módulo de conversión NEBNext Enzymatic 5hmC-seq (NEB #E3365)? R: El protocolo se ha optimizado para insumos de entre 0,1 y 200 ng. P: ¿Cuál es la diferencia entre el kit NEBNext® Enzymatic 5hmC-seq (NEB #E3350) y el módulo de conversión NEBNext Enzymatic 5hmC-seq (NEB #E3365)? R: El kit NEBNext Enzymatic 5hmC-seq contiene reactivos para la construcción de bibliotecas NEBNext Ultra™ II y el adaptador E5hmC-seq™, reactivos para la glucosilación de 5hmC y la desaminación de citosina, la mezcla maestra NEBNext Q5U® y microesferas de purificación de muestras. El módulo de conversión enzimática 5hmC-seq se suministra con reactivos para la glucosilación de 5hmC y la desaminación de citosina, y ADN de control. No contiene el adaptador E5hmC-seq, reactivos para la construcción y amplificación de bibliotecas, ni microesferas de purificación de muestras. P: ¿Qué tampones se recomiendan para el cizallamiento de ADN al utilizar el kit NEBNext Enzymatic 5hmC-seq y el módulo de conversión NEBNext 5hmC-seq? R: El ADN debe cizallarse en TE 1X (Tris 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8,0), TE bajo (Tris 10 mM, EDTA 0,1 mM, pH 8,0) o Tris 10 mM, pH 7,5 u 8,0. No recomendamos usar TE 0,1X (Tris 1 mM, EDTA 0,1 mM, pH 8,0) ni agua. P: ¿Por qué, en algunas etapas del protocolo del módulo de conversión E5hmC-seq™, las perlas de purificación de muestras NEBNext® se comportan de forma diferente al limpiar la muestra? R: El comportamiento de las perlas varía según la limpieza y la reacción previa del módulo de conversión E5hmC-seq. El sedimento de perlas se seca rápidamente después de la reacción de glucosilación, por lo que es importante trabajar con rapidez en este paso. Además, durante la limpieza posterior a APOBEC, las perlas tienden a aglutinarse con mayor facilidad. No seque demasiado las microesferas antes de la elución del ADN, ya que esto puede dificultar la resuspensión de las microesferas y reducir potencialmente la recuperación del ADN. P: ¿Qué niveles de conversión son típicos con los ADN de control suministrados? R: Se proporcionan dos controles de ADN: ADN lambda no metilado y ADN T4 5hmC. El ADN T4 5hmC está hidroximetilado en los contextos CpG, CHG y CHH. Para el ADN lambda no metilado, se observa típicamente menos del 1% de hidroximetilación, lo que indica una eficiencia de conversión superior al 99%. Para el ADN T4 5hmC (todas las citosinas están hidroximetiladas), se detecta típicamente más del 96% de 5hmC en los tres contextos de secuencia de citosinas. P: ¿Se puede utilizar ADN fragmentado enzimáticamente en E5hmC-seq™? R: No recomendamos utilizar la mayoría de las mezclas de fragmentación de ADN basadas en enzimas disponibles comercialmente en el flujo de trabajo E5hmC-seq, ya que los procesos de cizallamiento basados ​​en enzimas pueden afectar las marcas de metilación en el ADN. Sin embargo, NEBNext UltraShear™ (NEB #M7634) ha sido diseñado específicamente para fragmentar el ADN y conservar las marcas de metilación. Para obtener recomendaciones específicas sobre la combinación de NEBNext UltraShear con NEBNext® E5hmC-seq, comuníquese con el soporte técnico de NEB. P: ¿Puedo usar NaOH (hidróxido de sodio) en lugar de formamida para desnaturalizar mi ADN antes de la reacción de desaminación en el protocolo E5hmC-seq? R: Sí, es posible usar NaOH, aunque se prefiere la formamida. Si se usa NaOH, es fundamental que la concentración de la solución de NaOH sea precisa y que el volumen añadido a la reacción sea exactamente de 4 μl. El NaOH es altamente corrosivo. Se deben seguir las normas de seguridad locales e institucionales al trabajar con NaOH. Si se realiza una dilución a partir de NaOH 2 N, asegúrese de que la solución madre tenga un pH mínimo de 12,5. Verifique el pH de la solución madre antes de usarla. Evite diluciones inexactas preparando un volumen suficiente de NaOH diluido para minimizar los errores de pipeteo. Recomendamos preparar al menos 1 ml. Prepare diluciones de NaOH frescas o conserve alícuotas diluidas a 20 °C hasta por 6 meses para evitar cambios en la concentración. El NaOH sólido es delicuescente (absorbe agua de la atmósfera). No se puede pesar con precisión. Por lo tanto, las soluciones preparadas a partir de pellets de NaOH deben titularse para alcanzar la concentración adecuada.","brand":"New England Biolabs","offers":[{"title":"Default Title","offer_id":46835527221417,"sku":"E3365S","price":0.99,"currency_code":"USD","in_stock":true}],"url":"https:\/\/iright.com\/es\/products\/neb-e3365s","provider":"Iright","version":"1.0","type":"link"}