{"product_id":"neb-e6840s","title":"Kit PURExpress® Δ (aa, ARNt) de New England Biolabs, E6840S","description":"\u003cb\u003eCategorías relacionadas con\u003c\/b\u003e PURExpress Síntesis de proteínas in vitro de PURExpress®, Expresión de proteínas libres de células, \u003cb\u003eAplicaciones\u003c\/b\u003e de expresión de proteínas PURExpress, Expresión de proteínas libres de células, \u003cb\u003eEspecificación de\u003c\/b\u003e expresión de proteínas \u003cb\u003eMateriales necesarios pero no suministrados\u003c\/b\u003e General: Incubadora a 37 °C Etiquetado: 35S-metionina (se recomienda \u0026gt;1000 Ci\/mmol, grado de traducción in vitro) Precipitación con TCA: Soluciones de TCA (25 %, 10 %), NaOH 1 M, casaminoácidos, etanol, filtros de fibra de vidrio, colector de filtración al vacío SDS-PAGE: Geles y tampón de ejecución, aparato de gel, fuente de alimentación, secador de gel Western Blotting: Aparato de transferencia, membrana, anticuerpos y reactivo de detección Purificación: Agarosa Ni-NTA, Amicon Ultra- 0,5 ml, filtros de centrífuga de membrana Ultracel- 100K \u003cb\u003ePreguntas frecuentes\u003c\/b\u003e P: ¿En qué se diferencia el kit Δ aa Δ tRNA E6840S del ¿Kit PURExpress E6800S? R: El ARNt y los aminoácidos se suministran por separado en este kit, lo que permite a los usuarios ejecutar una reacción de síntesis de proteínas añadiendo mezclas modificadas de AA y ARNt a la reacción. Para obtener información detallada de uso, consulte el manual del producto. P: Al usar PURExpress, ¿no pude sintetizar la proteína de control? R: Los componentes del kit están inactivados Es necesario almacenar todos los materiales a -80 °C y se debe minimizar el número de ciclos de congelación y descongelación. Contaminación por nucleasas Para evitar la contaminación por nucleasas, use guantes y use puntas y tubos libres de nucleasas. También recomendamos agregar inhibidor de ARNasa (p. ej., NEB n.º M0314) a las reacciones. P: Al usar PURExpress, ¿pude sintetizar la proteína diana, pero el producto de longitud completa no es una especie principal? R: La iniciación o la terminación de la traducción no son correctas La producción de proteína de longitud completa requiere una iniciación y una terminación adecuadas. Los sitios de entrada internos al ribosoma o la terminación prematura pueden producir proteínas truncadas no deseadas. La iniciación en codones AUG no auténticos y la terminación prematura son difíciles de controlar. Si hay muchos codones raros o el objetivo tiene un porcentaje inusualmente alto de un aminoácido en particular, la suplementación del ARNt \"faltante\" puede ser útil. P: Al usar PURExpress, logré sintetizar la proteína de control, pero la muestra objetivo no está presente o lo está con un bajo rendimiento. R: Contaminación por ARNasa. Los minikits comerciales de preparación son una herramienta útil para la preparación de ADN molde, pero a menudo son la fuente de la introducción de ARNasa A en la reacción de síntesis de proteínas in vitro. La inclusión del inhibidor de ARNasa (NEB #M0314S, 20 unidades\/25 μl de reacción) suele solucionar este problema. El diseño del ADN molde se ve comprometido. Asegúrese de que la secuencia del ADN molde sea correcta. Tanto la región codificante como las secuencias reguladoras deben ser correctas y estar en marco para garantizar que la traducción se inicie correctamente y que se obtenga un producto completo. Las secuencias reguladoras o el espaciado no óptimos pueden afectar negativamente la eficiencia de la traducción. La iniciación de la traducción es un paso clave para la síntesis proteica exitosa. La estructura secundaria o los codones raros al comienzo del ARNm pueden comprometer el proceso de iniciación y afectar negativamente la síntesis proteica. La adición de una buena región de iniciación (p. ej., los primeros diez codones de la proteína de unión a maltosa) puede ayudar, suponiendo que se pueda tolerar la adición de residuos a la secuencia diana. Alternativamente, usar PCR para modificar el extremo 5' del gen diana puede ser una estrategia exitosa para eliminar elementos estructurales secundarios o codones raros. El ADN molde está contaminado. Puede haber inhibidores de la transcripción o la traducción en el ADN. Un simple experimento de mezcla (ADN de control + ADN diana, en comparación con ADN de control solo) revelará si hay inhibidores presentes. Los inhibidores en el ADN diana reducirán el rendimiento de la proteína de control. No utilice ADN purificado a partir de geles de agarosa, ya que a menudo contienen inhibidores de la traducción (p. ej., bromuro de etidio). El SDS residual de los protocolos de preparación de plásmidos es otro contaminante común y puede eliminarse mediante extracción con fenol:cloroformo y precipitación con etanol. Al realizar la precipitación con etanol, recomendamos el uso de acetato de sodio en lugar de acetato de amonio, un inhibidor conocido de la traducción. Tenga cuidado de eliminar todos los rastros de etanol. Las plantillas producidas por PCR deben estar libres de productos de amplificación no específicos. Estos contaminantes pueden contener señales de transcripción y, por lo tanto, competir por los componentes de transcripción y\/o traducción y titularlos. Como resultado, los rendimientos pueden verse afectados y pueden producirse productos truncados no deseados. La concentración de ADN plantilla no es óptima La concentración de ADN plantilla es importante ya que la síntesis de proteínas in vitro es un equilibrio entre la transcripción y la traducción. Muy poca plantilla reduce la cantidad de ARNm traducido activamente, mientras que demasiada plantilla da como resultado la sobreproducción de ARNm y la sobrecarga del aparato traduccional. Recomendamos 250 ng de ADN plantilla para una reacción de 25 μl. La optimización con diferentes cantidades de ADN plantilla (por ejemplo, 25-1000 ng) puede mejorar el rendimiento de una proteína diana particular. Si se utilizó la absorbancia UV para calcular la concentración del ADN plantilla, tenga en cuenta que el ARN o el ADN cromosómico también absorberán la luz UV. Si su muestra contiene cantidades significativas de ARN o ADN cromosómico, la cantidad real de ADN molde podría ser inferior a la calculada. La relación 260 nm\/280 nm debe ser de 1,8. Analizar parte del ADN molde en un gel de agarosa podría revelar la presencia de otros ácidos nucleicos, así como cualquier degradación o tamaño incorrecto del ADN molde. P: ¿Dónde puedo encontrar preguntas frecuentes más detalladas sobre PURExpress? R: Haga clic para ver el conjunto completo de preguntas frecuentes sobre PURExpress. P: ¿Existen citas de PURExpress? R: Sí. Puede encontrar citas de PURExpress aquí.","brand":"New England Biolabs","offers":[{"title":"Default Title","offer_id":46835533840553,"sku":"E6840S","price":0.99,"currency_code":"USD","in_stock":true}],"url":"https:\/\/iright.com\/es\/products\/neb-e6840s","provider":"Iright","version":"1.0","type":"link"}