{"product_id":"neb-e8201s","title":"New England Biolabs, E8201S, sistema de fusión y purificación de MBP NEBExpress®","description":"\u003cb\u003eCategorías relacionadas\u003c\/b\u003e con NEBExpress Purificación de amilosa (etiqueta MBP),, Sistema de fusión y purificación de MBP de NEBExpress,, Expresión no T7, \u003cb\u003eAplicaciones\u003c\/b\u003e Insolubilidad de la proteína diana,, Expresión no T7,, Expresión de proteínas difíciles, \u003cb\u003ePreguntas frecuentes\u003c\/b\u003e P: ¿Qué cepa(s) recomiendan como huéspedes para los vectores pMAL? R: Recomendamos NEBExpress Competent E. coli (NEB #C2523). Esta es una cepa de E. coli B similar a T7 Express y BL21 (DE3), excepto que carece de la ARN polimerasa T7 (los vectores pMAL usan la ARN polimerasa de E. coli). NEB Express, T7 Express (NEB #C2566), BL21 (NEB #C2530) y BL21(DE3) (NEB #C2527) E. coli competentes dan todos resultados similares: la presencia de la ARN polimerasa T7 no parece tener ningún efecto. Otras cepas exitosas incluyen NEB 10-beta (NEB #C3019) y NEB Turbo (NEB #C2984) E. coli competente. Se puede comenzar con NEB Express o con cualquier célula competente disponible, y luego probar con otra cepa si surge un problema de expresión o purificación. P: ¿Qué cebadores debo usar para secuenciar los extremos de mi inserto después de clonarlo en un vector pMAL? R: Se pueden usar los siguientes cebadores de secuenciación (no disponibles en New England Biolabs): el cebador malE en el extremo 5′ del inserto y el cebador inverso pMAL para secuenciar desde el extremo 3′. Cebador directo (24-mer, aguas arriba de MCS) 5′d(GGTCGTCAGACTGTCGATGAAGCC)3′ Cebador inverso (24-mer, aguas abajo de MCS) 5′d(TGTCCTACTCAGGAGAGCGTTCAC)3′ Las secuencias de los vectores pMAL también están disponibles en www.neb.com. La PCR de insertos clonados en el MCS se puede realizar utilizando el mismo par de cebadores. P: ¿Cuál es el tamaño mínimo de un fragmento que se puede clonar en pMAL y expresar fusionado a MBP? ¿Se pueden agregar secuencias peptídicas cortas (~ 10 aminoácidos) a MBP? R: El sistema MBP se puede utilizar para expresar péptidos cortos. Sin embargo, 40 mg de MBP producen ~1 mg de un péptido de 10 aminoácidos (1,1 kDa). P: ¿Cuántas veces puedo utilizar la columna de amilosa? R: La variable más importante para determinar la vida útil de la resina de amilosa es el tiempo que está en contacto con trazas de amilasa presentes en el extracto crudo. En condiciones normales (extracto crudo de 1 litro de células cultivadas en LB + 0,2 % de glucosa, columna de 15 ml), la columna pierde entre el 1 % y el 3 % de su capacidad de unión inicial cada vez que se utiliza. Si el rendimiento de la proteína de fusión en estas condiciones es de 40 mg, esto significa que después de 3 a 5 ejecuciones habría una disminución en el rendimiento. En la práctica, a menudo usamos una columna de 8 a 10 veces antes de notar una caída significativa en el rendimiento. P: ¿Puedo sustituir un tampón o una concentración de sal diferente en el tampón de columna? R: Sí, se pueden utilizar tampones HEPES, MOPS y fosfato (a valores de pH de 6,5 a 8,5) en lugar de Tris-HCl en el tampón de columna con resultados similares. Las concentraciones de NaCl o KCl de 25 mM a 1 M también son compatibles con la purificación por afinidad. P: ¿Puedo realizar una purificación por lotes con la resina de amilosa? R: Sí, la purificación por lotes funciona bien, aunque es difícil eliminar todas las proteínas inespecíficas con la misma eficacia que en una columna debido al volumen incluido en la resina. La resina puede soportar la centrifugación a hasta 6000 x g. Una buena solución es cargar la resina en modo por lotes, incubándola con agitación durante 2 horas o toda la noche, y luego verterla en una columna para lavarla y eluirla. La dilución del extracto crudo puede no ser crítica para cargar la columna mediante el método por lotes. P: ¿Se pueden purificar las fusiones de MBP en presencia de desnaturalizantes como urea o clorhidrato de guanidina? R: No, la afinidad de la MBP por la amilosa y la maltosa depende de los enlaces de hidrógeno que, a su vez, están posicionados por la estructura tridimensional de la proteína. Los agentes que interfieren con los enlaces de hidrógeno o la estructura de la proteína también interfieren con la unión. P: ¿Cómo se puede eliminar la proteasa TEV de la reacción después de la escisión? R: La proteasa TEV contiene una etiqueta de polihistidina en su extremo N-terminal y se puede eliminar de la reacción mediante cromatografía de afinidad por metales inmovilizados, como las perlas magnéticas de Ni-NTA NEBExpress (NEB #S1423), las columnas de centrifugación de Ni NEBExpress (NEB #S1427) o la resina de Ni NEBExpress (NEB #S1428). Las perlas magnéticas de Ni-NTA requerirán diálisis para eliminar el DTT presente en el tampón de reacción de la proteasa TEV, mientras que los digestos de proteasa TEV se pueden cargar directamente en las columnas de centrifugación de Ni NEBExpress o en la resina de Ni NEBExpress, ya que estos dos formatos de resina son químicamente resistentes al DTT. P: ¿La velocidad de escisión de la proteasa TEV se ve afectada por la urea o el clorhidrato de guanidina? A: La actividad de la proteasa TEV en una proteína de fusión MBP en presencia de estos desnaturalizantes ha sido reportada por C. Sun et al. de la siguiente manera: Urea: En hasta 2 M de urea se detecta una escisión casi completa. Hay cierta inhibición de la escisión de la proteasa TEV en concentraciones de urea de 4 M. Clorhidrato de guanidina: 1 M de clorhidrato de guanidina produce una ligera inhibición de la escisión de la proteasa TEV; sin embargo, todavía se observa cierta actividad de la proteasa TEV en presencia de 3 M de clorhidrato de guanidina. Sun, C. et al. (2012) Protein Expression and Purification 82, 226–231. P: ¿Cómo separo la MBP y la proteasa TEV de la proteína de interés? R: Tanto la MBP como la proteasa TEV contienen etiquetas de polihistidina que pueden usarse para eliminarlas de la proteína de interés. La digestión con proteasa TEV se puede cargar directamente en las columnas de centrifugación de Ni NEBExpress (NEB #S1427) o en la resina de Ni NEBExpress (NEB #S1428), ya que estos formatos de resina son químicamente resistentes al DTT en el tampón de reacción de la proteasa TEV. Si se utilizan las perlas magnéticas de Ni-NTA NEBExpress (NEB #S1423) u otro formato de cromatografía de afinidad con metales inmovilizados, recomendamos dializar la digestión con proteasa TEV en un tampón compatible antes de la IMAC. P: Quiero volver a unir la MBP a la columna de amilosa, pero es necesario eliminar la maltosa. ¿Es posible hacerlo mediante diálisis? R: La diálisis no es muy eficaz para eliminar la maltosa de la proteína de unión a la maltosa. Este es un fenómeno general de las interacciones entre la proteína de unión y el ligando; una vez que el ligando libre desaparece, el ligando liberado del sitio de unión suele encontrar otro sitio de unión antes de llegar a la membrana de diálisis. Hemos determinado empíricamente que unir la fusión a una resina cromatográfica y luego lavar la maltosa es mucho más efectivo. La cromatografía estándar (p. ej., DEAE) es un paso de separación preferido, ya que puede separar la proteasa TEV y la MBP de la proteína de interés si la cromatografía de afinidad con metales inmovilizados no es una opción. En caso de que la MBP coeluya con la proteína de interés, incluimos un paso de lavado de gran volumen para eliminar la maltosa antes de comenzar el gradiente salino. De esta manera, la mezcla puede procesarse posteriormente sobre una columna de amilosa si es necesario. Como alternativa, recomendamos utilizar las etiquetas de polihistidina presentes tanto en la MBP como en la proteasa TEV con cromatografía de afinidad con metales inmovilizados para separarlas de la proteína de interés después de la digestión con la proteasa TEV. P: ¿Cómo debo almacenar mi proteína después de purificarla? R: La mayoría de las proteínas pueden almacenarse durante al menos unos días a 4 °C sin desnaturalizarse. Para el almacenamiento a largo plazo, se puede congelar a -70 °C o dializar en glicerol al 50 % y almacenar a -20 °C. Al almacenar a -70 °C, se debe alícuota la proteína de modo que solo se deba descongelar la porción que se va a utilizar; los ciclos repetidos de congelación\/descongelación desnaturalizan muchas proteínas. P: ¿Qué es MBP6? ¿Es diferente de la MBP de tipo salvaje producida a partir de E. coli? R: MBP6 es la proteína producida a partir de pMAL-c6T que utiliza el codón de parada natural que sigue a la secuencia de reconocimiento SbfI. Se diferencia de la MBP de tipo salvaje por la adición de una metionina en el extremo N (al igual que todas las fusiones realizadas en vectores pMAL-c), las mutaciones que aumentan la afinidad de la MBP por la resina de amilosa, la eliminación de los últimos cuatro residuos de la MBP de tipo salvaje y la adición de los residuos codificados por el espaciador y el sitio de la proteasa TEV. MBP6 es un monómero con un peso molecular de 45,5 kDa y un pI calculado de 4,9. P: ¿Qué columna de gravedad recomiendan? R: Recomendamos la línea de columnas Econo de 2,5 cm (diámetro interno) de Bio-Rad o la Kontes Flex-Column. Los tamaños de columna (diámetro interno y longitud) se pueden aumentar o reducir y deben basarse en la cantidad de resina necesaria para aislar la proteína de interés con rendimientos suficientes. P: ¿Se daña la resina de amilosa por el almacenamiento a -20 °C? R: Recomendamos que las perlas se almacenen a 4 °C y nunca se congelen. La resina se congelará a -20 °C, pero su rendimiento no se degrada con un ciclo de congelación\/descongelación. Congelar el producto en una solución distinta a nuestra solución de almacenamiento (es decir, en ausencia de etanol al 20 %) puede reducir el rendimiento o degradar la resina, por lo que el cliente debe verificar el rendimiento funcional antes de su uso. P: ¿Qué se sabe sobre la unión en presencia de detergentes no iónicos? R: Algunas proteínas de fusión no se unen eficazmente (\u0026lt;5 % de unión) en presencia de Triton X-100 al 0,2 % o Tween 20 al 0,25 %, mientras que otras fusiones no se ven afectadas. En el caso de una fusión que no se une en Tween 20 al 0,25 %, la dilución de Tween al 0,05 % restaura aproximadamente el 80 % de la unión.","brand":"New England Biolabs","offers":[{"title":"Default Title","offer_id":46835482853545,"sku":"E8201S","price":0.99,"currency_code":"USD","in_stock":true}],"url":"https:\/\/iright.com\/es\/products\/neb-e8201s","provider":"Iright","version":"1.0","type":"link"}