{"product_id":"neb-m0274s","title":"New England Biolabs, M0274S, ADN polimerasa T7 (sin modificar)","description":"La ADN polimerasa T7 cataliza la replicación del ADN del fago T7 durante la infección. Su alta tasa de polimerización evita las incubaciones prolongadas. \u003cb\u003eCategorías relacionadas:\u003c\/b\u003e Manipulación del ADN, \u003cb\u003eAplicaciones,\u003c\/b\u003e Amplificación isotérmica, PCR, \u003cb\u003eEspecificación,\u003c\/b\u003e \u003cb\u003eDefinición de unidad.\u003c\/b\u003e Una unidad se define como la cantidad de enzima que incorpora 10 nmoles de dNTP en material insoluble en ácido en 30 minutos a 37 °C. \u003cb\u003eCondiciones de reacción\u003c\/b\u003e Suplemento de tampón de reacción de la ADN polimerasa T7 1X con albúmina recombinante, grado de biología molecular Incubar a 37 °C Tampón de reacción de la ADN polimerasa T7 1X Tris-HCl 20 mM MgCl2 10 mM DTT 1 mM (pH 7,5 a 25 °C) \u003cb\u003eTampón de almacenamiento\u003c\/b\u003e 50 mM KPO4 1 mM DTT 0,1 mM EDTA Glicerol al 50 % pH 7 a 25 °C \u003cb\u003eInactivación por calor\u003c\/b\u003e 75 °C durante 20 minutos \u003cb\u003eExonucleasa 5' - 3'\u003c\/b\u003e No \u003cb\u003eExonucleasa 3' - 5'\u003c\/b\u003e Sí \u003cb\u003eDesplazamiento de cadena\u003c\/b\u003e No \u003cb\u003eCondiciones del ensayo unitario\u003c\/b\u003e 100 mM KCl, 20 mM Tris-HCl (pH 7,6), 6 mM MgCl2, 0,5 mM DTT, 0,1 mM EDTA, 50 ug\/ml Albúmina recombinante, 150 μM dNTPs incluyendo [3H]-dTTP y 70 µg\/ml ADN de esperma de arenque desnaturalizado. \u003cb\u003eTasa de error\u003c\/b\u003e ~ 15x10 -6 bases \u003cb\u003ePreguntas frecuentes\u003c\/b\u003e P: ¿Qué ADN polimerasa puedo usar para hacer embotar el ADN? R: Nota: los dNTP deben añadirse a las reacciones de embotado Recomendamos principalmente la ADN polimerasa I, fragmento grande (Klenow) (M0210) para hacer embotado. La actividad óptima de embotado es a temperatura ambiente (25 °C). La ADN polimerasa T4 (M0203) también se puede usar para hacer embotado, pero debe usarse a 12 °C para prevenir la formación de extremos hundidos debido a su muy fuerte actividad exonucleasa 3'-5'. Para hacer embotado a temperaturas termófilas, recomendamos la ADN polimerasa Vent (M0254) o Deep Vent (M0258). Si bien la polimerasa de alta fidelidad Q5 también puede usarse para el despuntado a temperaturas termófilas, presenta requisitos de tampón muy estrictos para una actividad óptima y solo debe usarse con el tampón de reacción Q5. La nucleasa de frijol mungo (M0250) es nuestra única enzima de catálogo capaz de eliminar los extremos salientes 5'. Para la inactivación, recomendamos calentar con EDTA; haga clic aquí para consultar nuestras directrices de inactivación. Más información. Las ADN polimerasas se utilizan a menudo para el despuntado rellenando los extremos salientes 5' (actividad de polimerización 5' → 3') o reabsorbiendo los extremos salientes 3' (actividad de exonucleasa 3' → 5'). En ausencia de dNTP, la actividad de la exonucleasa 3'-5' superará a la actividad de la polimerasa 5'-3', eliminando más nucleótidos de los deseados. Sin embargo, la enzima prefiere la actividad de polimerización 5'-3' en comparación con la actividad de exonucleasa 3'-5' en presencia de dNTP. La presencia de dNTP garantiza que los nucleótidos se rellenen a través del molde, lo que resulta en extremos romos. Para obtener más información, consulte nuestras otras preguntas frecuentes: ¿Qué significa la actividad de exonucleasa para una ADN polimerasa? ¿Qué extremos tendrán mis productos de PCR? P: ¿Puedo usar una ADN polimerasa para rellenar los salientes 3' o eliminar los salientes 5'? R: No, las ADN polimerasas no pueden rellenar los salientes 3' porque solo pueden agregar nucleótidos en la dirección 5'-3'. Para eliminar los salientes 3', consulte nuestras preguntas frecuentes sobre el despuntado. No, las ADN polimerasas no pueden eliminar los salientes 5'. La Nucleasa de Frijol Mung (M0250) es la única enzima del catálogo que puede eliminar los salientes 5'. P: ¿Cómo puedo inactivar por calor esta ADN polimerasa? R: Para la ADN polimerasa I (M0209), el fragmento Klenow grande (M0210), la ADN polimerasa T4 (M0203) y la ADN polimerasa T7 (M0274): Para evitar la formación de extremos retraídos (más allá del punto de despuntado deseado), precaliente un baño María o un termociclador a 75 °C. Antes de colocar la muestra a 75 °C, añada EDTA a la muestra hasta una concentración final de 10 mM (para quelar el cofactor Mg₂+) y luego incube a 75 °C durante 20 minutos. Tenga en cuenta que las temperaturas elevadas, las cantidades excesivas de enzima, la falta de suplementación con dNTP o los tiempos de reacción prolongados provocarán extremos retraídos debido a la actividad exonucleasa 3' → 5' de la enzima. Fragmento Klenow (3' → 5' exo-): Inactívelo calentando a 75 °C durante 20 minutos. EDTA no es necesario debido a la falta de actividad exonucleasa 3'-5'. P: ¿Puede usarse esta ADN polimerasa en reacciones de marcaje y llenado parcial? R: Para una cobertura completa y uniformemente marcada, la ADN polimerasa I (E. coli) (M0209) es la enzima preferida. A temperaturas de reacción elevadas, también puede usarse la ADN polimerasa Taq. Para la generación de dsADN corto, fragmentado (~250 pb) de alto rendimiento, se recomienda el fragmento Klenow (3'→5' exo-) (M0212). Traducción de nick Cuando se usa la traducción de nick para generar sondas, normalmente se usa la ADNasa I para cortar el ADN. La ADN polimerasa I (E. coli) elimina las bases principales en el nick con su actividad exonucleasa 5'→3' y luego rellena con bases marcadas. Nucleótidos modificados Dado que la eficiencia de incorporación de nucleótidos modificados es generalmente menor que la de sus contrapartes naturales, un reemplazo del 100% puede causar que la polimerasa se detenga. Para equilibrar el rendimiento con la eficiencia del etiquetado, generalmente recomendamos probar varias proporciones de dNTP modificado a natural. Las siguientes polimerasas no se recomiendan para el etiquetado o reacciones de llenado parcial porque su actividad de exonucleasa 3'-5' es difícil de controlar: ADN polimerasa I, fragmento grande (Klenow) (M2010) ADN polimerasa T4 (M0203) ADN polimerasa T7 (M0274) P: ¿Cuáles son las principales causas del fracaso de la reacción de embotamiento? R: Las siguientes condiciones pueden causar que la actividad de la exonucleasa abrume la actividad de la polimerasa, causando extremos hundidos en lugar de romos: No agregar nucleótidos o la concentración de nucleótidos es demasiado baja Agregar demasiada enzima Incubar durante demasiado tiempo Incubar a temperaturas superiores a la temperatura recomendada Inactivación por calor sin EDTA Preguntas frecuentes: ¿Se puede inactivar por calor esta polimerasa? Consulte el protocolo de despuntado recomendado para la ADN polimerasa I, fragmento grande (Klenow) haciendo clic aquí. Para la ADN polimerasa T4, haga clic aquí. P: ¿Se puede usar esta ADN polimerasa en otros NEBuffers para rellenar o despuntar salientes? R: PARA RELLENAR SALPICADURAS 5' La ADN polimerasa I (E. coli), el fragmento grande de Klenow, el fragmento de Klenow (exo-3'-5') y la ADN polimerasa T4 son activas en todos los NEBuffers, pero NEBuffer 2\/2.1\/r2.1 proporciona una actividad óptima. La ADN polimerasa T7 tiene una actividad óptima en su propio tampón, y su actividad se reduce un 50 % en los otros NEBuffers. Para comparar las composiciones de NEBuffers, haga clic aquí. Para ver la actividad de más enzimas modificadoras de ADN en el tampón rCutSmart, haga clic aquí. PARA DESBORDAR SOBRANTES NEBuffers ADN polimerasa I (E. coli) ADN polimerasa I, fragmento grande (Klenow) ADN polimerasa T4 ADN polimerasa T7 1 YNY 50% 1.1 YNY 50% r1.1 YNY 50% 2 Óptimo Óptimo Y 50% 2.1 YYY 50% r2.1 YY Óptimo 50% 3 YYN 50% 3.1 YYN 50% r3.1 YYN 50% 4 YYY 50% CutSmart YYY 50% rCutSmart YYY 50% Tampón de ligasa de ADN T4 YY Tampón de reacción de polimerasa de ADN T7 Óptimo \"Y\" significa sí, esta polimerasa se puede usar en el tampón especificado. \"N\" significa no, esta polimerasa no se puede usar en el tampón especificado. Se indican los tampones óptimos. Klenow (exo-3'-5') no se puede usar para eliminar salientes. P: ¿NEB comercializa la ADN polimerasa T7 modificada? R: No, NEB no tiene licencia para vender la ADN polimerasa T7 modificada. GE Healthcare comercializa la marca Sequenase™.","brand":"New England Biolabs","offers":[{"title":"Default Title","offer_id":46835491700905,"sku":"M0274S","price":0.99,"currency_code":"USD","in_stock":true}],"url":"https:\/\/iright.com\/es\/products\/neb-m0274s","provider":"Iright","version":"1.0","type":"link"}