{"product_id":"neb-m0368l","title":"New England Biolabs, M0368L, ProtoScript® II Transcriptasa inversa","description":"\u003cb\u003eCategorías relacionadas\u003c\/b\u003e RT-PCR,, Síntesis de ADNc y transcriptasas inversas \u003cb\u003eAplicaciones\u003c\/b\u003e Amplificación dependiente de helicasa,, Síntesis de ADNc,, Transcripción inversa (síntesis de ADNc), \u003cb\u003eDefinición de unidad\u003c\/b\u003e \u003cb\u003ede especificación\u003c\/b\u003e Una unidad se define como la cantidad de enzima que incorporará 1 nmol de dTTP en material insoluble en ácido en un volumen de reacción total de 50 μl en 10 minutos a 37 °C utilizando poli(rA)•oligo(dT) 18 como plantilla. \u003cb\u003eCondiciones de reacción\u003c\/b\u003e Tampón de reacción de transcriptasa inversa ProtoScript® II 1X Incubar a 42 °C Tampón de reacción de transcriptasa inversa ProtoScript® II 1X Tris-HCl 50 mM KCl 75 mM MgCl2 3 mM (pH 8,3 a 25 °C) \u003cb\u003eTampón de almacenamiento\u003c\/b\u003e Tris-HCl 20 mM NaCl 100 mM DTT 1 mM EDTA 0,1 mM Glicerol al 50 % IGEPAL® CA-630 al 0,01 % pH 7,5 a 25 °C \u003cb\u003eInactivación por calor\u003c\/b\u003e 65 °C durante 20 minutos \u003cb\u003eCondiciones del ensayo de la unidad\u003c\/b\u003e Tris-HCl 50 mM (pH 8,3), KCl 75 mM, MgCl2 6 mM, ditiotreitol 10 mM, IGEPAL CA-630 al 0,01 %, 0,5 mM dTTP, 0,4 mM poly(rA)•oligo(dT) 18 . \u003cb\u003ePreguntas frecuentes\u003c\/b\u003e P: ¿Cuál es la diferencia entre NEB# M0368 y NEB# M0253? R: M0368 es una transcriptasa inversa M-MuLV mutante con actividad de RNasa H reducida y mayor termoestabilidad. La enzima es activa hasta 50 °C, lo que proporciona mayor especificidad, mayor rendimiento de ADNc y un producto de ADNc de longitud completa. P: ¿Cuál es la temperatura de reacción óptima para la transcriptasa inversa ProtoScript II (M0368)? R: La transcriptasa inversa ProtoScript II es capaz de generar ADNc de más de 10 kb hasta 48 °C. Recomendamos 42 °C para la transcripción inversa de rutina. P: ¿Se pueden utilizar los productos de ADNc en el análisis de PCR en tiempo real? R: Sí. Los productos de ADNc generados por la transcriptasa inversa ProtoScript II se pueden utilizar directamente para el análisis de PCR en tiempo real. P: ¿Qué ADN polimerasa termoestable se puede utilizar para PCR después de la síntesis de ADNc? R: Para PCR downstream, recomendamos OneTaq 2X Master Mix (NEB #M0482 o M0485) para detección por PCR de hasta 5 kb, Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix (NEB #M0494) para la más alta fidelidad, o LongAmp Taq 2X Master Mix (NEB #M0287) para altos rendimientos de productos más largos. P: ¿Cómo se puede mejorar el rendimiento al utilizar la transcriptasa inversa ProtoScript II? R: Se puede utilizar una mayor cantidad de enzima hasta 1000 U por 20 ul de reacción de síntesis de ADNc y aumentar la concentración de dNTP hasta 1 mM. P: ¿Cómo se puede aumentar la longitud del producto generado por la transcriptasa inversa M-MuLV? R: La incubación a 42 °C puede relajar parte de la estructura secundaria del ARN, lo que permite que la transcriptasa inversa M-MuLV produzca productos más largos. P: ¿Es necesario el tratamiento con RNasa H antes de la amplificación por PCR? R: Para la mayoría de las reacciones de RT-PCR, no se requiere el tratamiento con RNasa H. Sin embargo, para algunos amplicones difíciles o ensayos sensibles, añada 2 U de RNasa H de E. coli a la reacción e incube a 37 °C durante 20 min. P: ¿Cuál es la diferencia entre la transcriptasa inversa Induro (NEB n.° M0681) y la transcriptasa inversa ProtoScript II (NEB n.° M0368)? R: Existen principalmente dos tipos de transcriptasas inversas (RT): las RT codificadas por retrovirus y las RT codificadas por intrones. Ambos tipos de RT comparten algunos dominios conservados y sintetizan ADN complementario a partir de un molde de ARN. Las RT más comunes y mejor caracterizadas derivan de retrovirus como el virus de la leucemia murina de Moloney (M-MuLV, MMLV), como la transcriptasa inversa ProtoScript II. Por el contrario, la transcriptasa inversa Induro es una RT codificada por intrones del grupo II que exhibe mayor termoestabilidad, procesividad más rápida y mejor tolerancia a los componentes de la reacción en comparación con las RT retrovirales. La transcriptasa inversa Induro es útil para la síntesis de ADNc a partir de transcripciones largas, ARN con estructuras secundarias fuertes y muestras de ARN con inhibidores. P: ¿Por qué tengo bajos rendimientos de ADNc? R: Hay varias causas para un bajo rendimiento de ADNc. Aquí hay algunas sugerencias para mejorar el rendimiento: Verifique la integridad del ARN mediante electroforesis en gel de agarosa desnaturalizante o BioAnalyzer (Agilent). El ARN intacto de alta pureza es esencial para la síntesis completa de ADNc. El ARN debe tener una relación mínima A260\/A280 de 1,7 o un número RIN mayor que 8. La precipitación con etanol seguida de un lavado con etanol al 70% puede eliminar contaminantes como EDTA y guanidinio. La precipitación con cloruro de litio puede eliminar polisacáridos. Un paso de purificación de ARN mediante kits de extracción de ARN o extracción con fenol\/cloroformo puede eliminar proteínas contaminantes como las proteasas. Aumente la cantidad de ARN utilizado, especialmente si el ARN es poco abundante. P: ¿Cómo sé si mi ARN molde es de buena calidad? R: Un ARN intacto de alta pureza es esencial para la síntesis completa de ADNc. Una relación de absorbancia A260\/A280 superior a 1,7 o un número RIN superior a 8 en un BioAnalyzer suele indicar ARN de alta calidad.","brand":"New England Biolabs","offers":[{"title":"Default Title","offer_id":46835484655785,"sku":"M0368L","price":0.99,"currency_code":"USD","in_stock":true}],"url":"https:\/\/iright.com\/es\/products\/neb-m0368l","provider":"Iright","version":"1.0","type":"link"}