{"product_id":"neb-p0703s","title":"Laboratorios biológicos de Nueva Inglaterra, P0703S, Endo Hf","description":"Endo Hf es una proteína recombinante de fusión de Endoglicosidasa H y proteína de unión a maltosa. Endo Hf escinde dentro del núcleo de quitobiosa de alta manosa y algunos oligosacáridos híbridos de glicoproteínas ligadas a N tan bien como Endo H. \u003cb\u003eCategorías relacionadas\u003c\/b\u003e Endoglicosidasas,, \u003cb\u003eAplicaciones de\u003c\/b\u003e análisis de proteomas Sistemas de expresión,, Secuenciación de glicanos,, Proteómica, \u003cb\u003eEspecificación\u003c\/b\u003e \u003cb\u003eDefinición de unidad\u003c\/b\u003e Una unidad se define como la cantidad de enzima requerida para eliminar \u0026gt; 95% del carbohidrato de 10 µg de RNasa B desnaturalizada en 1 hora a 37°C en un volumen de reacción total de 10 μl (10 unidades NEB = 1 miliunidad IUB). Ensayo de definición de unidad: 10 µg de RNasa B se desnaturalizan con tampón desnaturalizante de glicoproteínas 1X (0,5% SDS, 40 mM DTT) a 100°C durante 10 minutos. Después de la adición de 1X GlycoBuffer 3, se añaden diluciones dobles de Endo H f y la mezcla de reacción se incuba durante 1 hora a 37 °C. La separación de los productos de reacción se visualiza por SDS-PAGE. 1X Glycoprotein Denaturing Buffer 0.5% SDS 40 mM DTT \u003cb\u003eCondiciones de reacción\u003c\/b\u003e 1X GlycoBuffer 3 Incubar a 37 °C 1X GlycoBuffer 3 50 mM acetato de sodio (pH 6 a 25 °C) \u003cb\u003eTampón de almacenamiento\u003c\/b\u003e 20 mM Tris-HCl 50 mM NaCl 5 mM EDTA pH 7.5 a 25 °C \u003cb\u003eInactivación por calor\u003c\/b\u003e 75 °C durante 10 minutos \u003cb\u003ePeso molecular\u003c\/b\u003e aparente: 70 kDa \u003cb\u003ePreguntas frecuentes\u003c\/b\u003e P: ¿Cuál es la diferencia entre PNGase F y Endo H? A: PNGase F elimina casi todos los tipos de glicosilación ligada a N (ligada a Asn): alta manosa, híbrida, bi-, tri- y tetra-antenaria. Elegirás esta enzima si tu objetivo es eliminar todos los carbohidratos ligados a N sin importar el tipo. Endo H elimina solo alta manosa y algunos tipos híbridos de carbohidratos ligados a N. Elegirías esta enzima para determinar más de cerca el tipo de glicosilación ligada a N, o si sabes que la proteína tiene un carbohidrato sensible a Endo H. P: ¿Cuál es la diferencia entre Endo H y Endo Hf? R: Endo H y Endo Hf son la misma enzima, pero Endo Hf es la proteína de fusión de Endo H y MBP. El clon fue diseñado con la MBP unida para ayudar en la purificación de la enzima. La proteína de fusión tiene una actividad idéntica al clon sin fusión. No hay diferencia en la actividad entre Endo H y Endo Hf en una glicoproteína. P: Probé la Endo H\/Hf en mi glicoproteína y falló. ¿Cuál podría ser el problema? R: Primero, ¿sabe cómo se une el carbohidrato a la proteína? ¿Está unido a un N o a un O (ligado a un Asp o Ser\/Thr)? Segundo, ¿el sustrato del carbohidrato es de tipo manosa alta? Si no está seguro, una endoglicosidasa más general, la PNGasa F, podría ser la enzima más apropiada. Si está seguro de que hay carbohidratos unidos a un N con alto contenido de manosa, asegúrese de haber desnaturalizado la proteína antes de la desglicosilación. La estructura secundaria y terciaria de las proteínas a menudo impide que las endoglicosidasas alcancen su sustrato, lo que hace que la desnaturalización sea un paso crucial para una escisión eficiente. Si no desea desnaturalizar, considere agregar más enzima e incubar durante más tiempo. Recuerde que la Endo H\/Hf elimina específicamente solo los carbohidratos de tipo manosa alta y algunos carbohidratos de tipo híbrido de las glicoproteínas. Si el carbohidrato es más complejo, la Endo H no se escindirá. La PNGasa F es útil para eliminar todos los tipos de carbohidratos N-enlazados de las glicoproteínas. P: ¿Cuánta Endo H\/Endo Hf debo usar? R: 1-2 ul de Endo H\/Hf son suficientes para desglicosilar de 5 a 20 μg de glicoproteína desnaturalizada en una hora. P: ¿El SDS inhibe la EndoH\/Endo Hf? R: No. P: ¿Cuáles son las condiciones de reacción típicas para la Endo Hf? R: Las condiciones de reacción típicas son las siguientes: 1. Combinar de 1 a 20 µg de glicoproteína, 1 µl de tampón desnaturalizante de glicoproteínas 10X y H₂O (si es necesario) para obtener un volumen total de reacción de 10 µl. 2. Desnaturalizar la glicoproteína calentando la reacción a 100 °C durante 10 minutos. 3. Prepare un volumen total de reacción de 20 µl añadiendo 2 µl de tampón de glicosilación 3 10X, H₂O y 1-5 µl de Endo H. 4. Incube la reacción a 37 °C durante 1 hora. Nota: Las reacciones pueden aumentarse linealmente para acomodar volúmenes de reacción mayores. P: ¿Son aceptables los inhibidores de la proteasa para su uso en una reacción Endo H\/Hf? R: Aprotinina (concentración final de 10 μg\/ml) Benzamidina (concentración final de 1 mM) Pepstatina (concentración final de 10 μg\/ml) Leupeptina (concentración final de 1 μM) EGTA (concentración final de 1 mM) EDTA (concentración final de 1 mM) PMSF (concentración final de 1 mM) Prepare una solución madre concentrada 1000X de cada inhibidor en agua; excepto la pepstatina, que debe disolverse en metanol. Nota: El PMSF tiene la capacidad de modificar residuos básicos en sustratos de glicoproteína. P: ¿Por qué las enzimas NEB Glicosidasas han cambiado de tampón de reacción? ¿Cuáles son los nuevos tampones de reacción? ¿Puedo seguir utilizando una enzima con su tampón anterior? ¿Dónde puedo consultar la composición de los tampones anteriores? R: Para simplificar los flujos de trabajo y las digestiones con dos o más exoglicosidasas, la mayoría de las enzimas ahora se suministran con GlycoBuffer 1 10X. Dos excepciones se suministran con GlycoBuffer 4. Además, se ha simplificado el panel de tampones para endoglicosidasas. Se evaluó la actividad de cada enzima endo y exoglicosidasa tanto en su sistema de tampón anterior como en el nuevo. Todas las enzimas conservan la misma actividad o presentan una mayor actividad en el nuevo tampón. Algunas exoglicosidasas aún se suministran con un vial adicional de rHSA (la rHSA potencia la actividad de ciertas enzimas). Como antes, algunas exoglicosidasas aún se suministran con un vial adicional de BSA (la BSA potencia la actividad de ciertas enzimas). Se siguen suministrando otros componentes (p. ej., tampón desnaturalizante de glicoproteínas, NP-40, etc.) cuando se requieren. Enzima Producto n.° Tampón anterior Tampón actual ¿Cambió? α-N-acetilgalactosaminidasa P0734 G7 GlycoBuffer 1 SÍ α1-2 Fucosidasa P0724 G4 GlycoBuffer 1 SÍ α1-2,3,4,6 Fucosidasa P0748 --- GlycoBuffer 1 --- α1-2,4,6 Fucosidasa O p0749 --- GlycoBuffer 1 --- α1-3,4 Fucosidasa p0769 --- GlycoBuffer 1 --- α1-2,3 Manosidasa P0729 G6 GlycoBuffer 1 no α1-6 Manosidasa P0727 G2 GlycoBuffer 1 SÍ α1-2,3,6 Manosidasa p0768 --- GlycoBuffer 4 --- α1-3,4,6 Galactosidasa P0747 --- GlycoBuffer 1 ---- α1-3,6 Galactosidasa P0731 G6 GlycoBuffer 1 no α2-3 Neuraminidasa S P0743 --- GlycoBuffer 1 --- α2-3,6,8 Neuraminidasa P0720 G1 GlycoBuffer 1 SÍ α2-3,6,8,9 Neuraminidasa A P0722 --- GlycoBuffer 1 --- β-N-Acetilhexosaminidasef P0721 G2 GlycoBuffer 1 SÍ β-N-Acetilglucosaminidasa P0732 G1 GlycoBuffer 1 SÍ β-N-Acetilglucosaminidasa S P0744 --- GlycoBuffer 1 --- β1-3 Galactosidasa P0726 G6 GlycoBuffer 1 no β1-4 Galactosidasa S P0745 --- GlycoBuffer 1 --- β1-3,4 Galactosidasa p0746 --- GlycoBuffer 4 --- Kit de secuenciación de N-glicanos E0577 --- GlycoBuffer 1 --- Endo S P0741 G6 GlycoBuffer 1 SÍ Endo H P0702 G5 GlycoBuffer 3 SÍ Endo Hf P0703 G5 GlycoBuffer 3 SÍ Endo F2 p0772 --- GlycoBuffer 4 --- Endo F3 p0771 --- GlycoBuffer 4 --- Endo D P0742 G7 GlycoBuffer 2 sin O-glicosidasa P0733 G7 GlycoBuffer 2 sin O-glicosidasa y neuraminidasa Bundle E0540 G7 GlycoBuffer 2 sin Remove-iT® PNGase F P0706 G7 GlycoBuffer 2 sin PNGase F P0704 G7 GlycoBuffer 2 sin PNGasa F (sin glicerol) P0705 G7 GlycoBuffer 2 sin PNGasa F, recombinante P0708 G7 GlycoBuffer 2 sin PNGasa F (sin glicerol), recombinante P0709 G7 GlycoBuffer 2 sin PNGasa A p0707 --- Glyco Buffer 3 --- Protein Deglycosylation Mix II p6044 --- Deglycosylation Mix Buffer 1 y 2 --- Rapid PNGase F P0710 --- Rapid PNGase F Buffer ---- Rapid™ PNGase F (formato no reductor) p0711 --- Rapid PNGase F (formato no reductor) Buffer P: ¿Cuál es un buen sustrato de endoglicosidasa? R: Para PNGaseF y Protein Deglycosylation Mix sugerimos Fetuin (NEB #P6042, suministrado con Protein Deglycosylation Mix). Para PNGasaF, Endo H y Endo Hf, sugerimos la ARNasa B (NEB n.° P7817). Para Endo D, sugerimos la Fosfolipasa A de veneno de abeja. Para Endo S, sugerimos la IgG monoclonal de ratón (NEB n.° E8032). Para la O-glicosidasa, sugerimos p-Nitrofenil galacto-N-biósido (Galβ1-3GalNAcα1pNP o Core1-pNP). Como alternativa, la fetuina puede digerirse con neuraminidasa, y neuraminidasa más O-glicosidasa. Los cambios en el peso molecular tras la eliminación de glicanos pueden observarse mediante SDS-PAGE. P: ¿Inhiben los detergentes las exoglucosidasas\/endoglucosidasas? R: A niveles moderados (0,5-1,0 % de detergentes iónicos y no iónicos), la mayoría de las glicosidasas muestran una actividad satisfactoria o no se ven afectadas. Las excepciones son: PNGasa F (todas las formulaciones), O-glicosidasa y β-N-acetilglucosaminidasa, que son inhibidas por SDS. Es imperativo agregar NP-40 a una concentración final del 1% a su mezcla de reacción para contrarrestar la inhibición del detergente. Endo D también es inhibida por SDS; sin embargo, NP-40 no contrarresta esta inhibición. Finalmente, los reactivos estabilizadores comunes como Tween, Triton X-100, NP-40, octil glucósido y sulfobetaínas no detergentes, así como trazas de solventes orgánicos, pueden impedir una desglicosilación rápida óptima por Rapid PNGase F. P: ¿Qué son las glicosidasas y sus usos? R: Las glicosidasas se utilizan para obtener información sobre los grupos de carbohidratos unidos a las glicoproteínas y los glicopéptidos. Existen dos variedades: las endoglicosidasas, que escinden grupos completos de carbohidratos de las proteínas, y las exoglicosidasas, que eliminan los monosacáridos de los extremos no reducidos del carbohidrato. Un extremo reducido es aquel generado por una endoglicosidasa. Los investigadores suelen utilizar una endoglicosidasa seguida de una o más exoglicosidasas y luego analizan los productos mediante SDS-PAGE o diversos tipos de cromatografía líquida.","brand":"New England Biolabs","offers":[{"title":"Default Title","offer_id":46835526762665,"sku":"P0703S","price":0.99,"currency_code":"USD","in_stock":true}],"url":"https:\/\/iright.com\/es\/products\/neb-p0703s","provider":"Iright","version":"1.0","type":"link"}