{"product_id":"neb-p0777s","title":"New England Biolabs, P0777S, Endo-β-galactosidasa","description":"La actividad \u003cb\u003eenzimática\u003c\/b\u003e está determinada por su capacidad para escindir más del 95% de 2 nmol de \u003cb\u003eGalβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc\u003c\/b\u003e -7-amino-4-metil-cumarina (AMC) utilizando menos de 10 ng de enzima en 1 hora a 37 °C, en \u003cb\u003eun\u003c\/b\u003e \u003cb\u003evolumen\u003c\/b\u003e de reacción total de 20 μl. \u003cb\u003eCondiciones de reacción\u003c\/b\u003e 1X GlycoBuffer 3 Incubar a 37 °C 1X GlycoBuffer 3 50 mM de acetato de sodio (pH 6 a 25 °C) \u003cb\u003eTampón de almacenamiento\u003c\/b\u003e 50 mM de acetato de sodio 50 mM NaCl pH 5,5 a 25 °C \u003cb\u003eInactivación por calor\u003c\/b\u003e 55 °C durante 10 minutos \u003cb\u003ePeso molecular\u003c\/b\u003e aparente: 40,8 kDa \u003cb\u003eCondiciones de ensayo unitario\u003c\/b\u003e Se incuban diluciones dobles de Endo-β-Galactosidasa con 2 nmol de sustrato marcado con AMC en 1X GlycoBuffer 3 en una reacción de 20 μl. La mezcla de reacción se incuba a 37 °C durante 1 hora. La separación de los productos de reacción se visualiza mediante cromatografía en capa fina. \u003cb\u003ePreguntas frecuentes\u003c\/b\u003e P: ¿Los detergentes inhiben la Endo-β-Galactosidasa (NEB n.º P0777)? R: La actividad de la endo-β-galactosidasa puede inhibirse con detergentes iónicos, como el SDS, en concentraciones moderadas (0,5-1%). Para contrarrestar esta inhibición, es esencial incluir NP-40 en una concentración final del 1% en la mezcla de reacción. Por el contrario, los detergentes no iónicos como Tween 20, Triton X-100 y NP-40 pueden estabilizar la endo-β-galactosidasa y potenciar su actividad específica. P: ¿Cuánta endo-β-galactosidasa (NEB n.° P0777) debe utilizarse en una reacción? R: La cantidad necesaria de endo-β-galactosidasa depende del sustrato específico. Como recomendación inicial, utilice 1-2 μl de enzima por cada 10-20 μg de glicoproteína en una reacción de 10 μl durante una hora a 37 °C. En nuestros estudios con una proteína conjugada con azúcar, observamos que la enzima funciona eficazmente en un amplio rango de proporciones molares proteína-enzima, de 2:1 a 150:1, lo que se traduce en una proporción de azúcar-enzima de aproximadamente 50 a 3500 veces en condiciones óptimas. Recomendamos comenzar con una proporción de 10:1 a 20:1 y realizar un experimento de titulación para optimizar las condiciones para su sustrato específico. P: ¿Puedo usar un tampón diferente al GlycoBuffer 3 que se suministra con la Endo-β-Galactosidasa (NEB n.° P0777)? R: Sí, puede usar un tampón diferente, ya que nuestra Endo-β-Galactosidasa (EBG) es activa en un amplio rango de pH (pH 3,5-9). Sin embargo, la escisión óptima se produce cerca de pH 6,0. A pH 8,0, la actividad disminuye a menos del 50% y se reduce aún más a pH 8,5 después de 1 hora a 37 °C en nuestro ensayo estándar. Para mejorar la escisión en condiciones de pH no óptimas, extienda el tiempo de incubación, aumente la cantidad de enzima o ambos. Además, la composición del tampón y la concentración de sal pueden afectar la eficiencia. Por ejemplo, en nuestros experimentos, un tampón de fosfato de sodio 50 mM (pH 7,4) funcionó mejor que 1x PBS al mismo pH. P: ¿Qué sucede si tengo una digestión incompleta al usar Endo-β-Galactosidasa (NEB #P0777)? R: La cantidad de enzima necesaria para una digestión completa depende de la estructura, pureza y cantidad del sustrato. Modificaciones como la ramificación o la fucosilación pueden reducir o inhibir la escisión enzimática, y los oligosacáridos en el grupo neolacto pueden escindirse a tasas significativamente reducidas. Para abordar la digestión incompleta, puede extender el tiempo de incubación, aumentar la concentración de enzimas o aplicar una combinación de ambos. Sin embargo, es poco probable que una incubación de más de 8 horas a 37 °C produzca una mejora significativa. P: ¿Cuál es la diferencia entre la endo-β-galactosidasa, la β1-4 galactosidasa, la β1-4 galactosidasa S y la β1-3,4 galactosidasa? R: La endo-β-galactosidasa (NEB n.° P0777S) es una endoglicosidasa, mientras que la β1-4 galactosidasa (NEB n.° P0730S), la β1-4 galactosidasa S (NEB n.° P0745S) y la β1-3,4 galactosidasa (NEB n.° P0746S) son exoglicosidasas. Estas enzimas se derivan de diferentes organismos y se dirigen a sustratos distintos. La endo-β-galactosidasa se clona a partir de Flavobacterium keratolyticus, la β1-4 galactosidasa a partir de Bacteroides fragilis, la β1-4 galactosidasa S a partir de Streptococcus pneumoniae y la β1-3,4 galactosidasa (BTG) a partir de testículo bovino. La endo-β-galactosidasa escinde los enlaces β(1-4)-galactosina internos dentro de las estructuras de poli-N-acetil-lactosamina [Galβ(1-4)-↓-GlcNAcβ(1-3)]. Por el contrario, la β1-4 galactosidasa y la β1-4 galactosidasa S escinden residuos externos de galactosa a través de enlaces β(1-4), mientras que la β1-3,4 galactosidasa (BTG) escinde residuos externos de galactosa unidos a través de enlaces β(1-3) y β(1-4).","brand":"New England Biolabs","offers":[{"title":"Default Title","offer_id":46835478790313,"sku":"P0777S","price":0.99,"currency_code":"USD","in_stock":true}],"url":"https:\/\/iright.com\/es\/products\/neb-p0777s","provider":"Iright","version":"1.0","type":"link"}