BD، 555236، مجموعة BD OptEIA™ Mouse IL-5 ELISA

التفاعل: الفأر (اختبار مراقبة الجودة)
التطبيق: اختبار ELISA (يتم اختباره بشكل روتيني)
الوضع التنظيمي: للاستخدام البحثي فقط
RRID: AB_2869048
الوصف: تحتوي مجموعة OptEIA™ الخاصة بإنترلوكين-5 (IL-5) الفأري على المكونات اللازمة لتطوير فحوصات الامتصاص المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA) لإنترلوكين-5 الفأري الطبيعي أو المُعاد تركيبه في المصل والبلازما وسوائل مزارع الخلايا. تُوفّر المجموعة مواد كافية لتحضير ما يقارب 20 صفيحة من 96 بئرًا، وذلك باتباع تعليمات التخزين والمواد وتحضير المحلول المنظم وإجراء الفحص الموصى بها والمحددة في هذه العبوة. تحسين الفحص: تتيح مجموعات BD OptEIA™ تصميمًا مرنًا للفحص بما يتناسب مع احتياجات كل مختبر. لتصميم فحص مناعي بحساسية ونطاق ديناميكي مختلفين، يمكن تغيير المعايير التالية: الالتقاط، الكشف، معايرة الأجسام المضادة، وقت الحضانة، درجة حرارة الحضانة، تركيبة مخفف الفحص، درجة حموضة المحلول المنظم، القوة الأيونية، تركيز البروتين، نوع الركيزة، تقنية الغسل (أي عدد مرات الغسل وأوقات النقع). المعايرة: تتم معايرة هذا الفحص المناعي مقابل IL-5 الفأر المؤتلف النقي المعبر عنه بواسطة فيروس باكولوفيروس.
التحضير والتخزين: تُحفظ الكواشف غير المفتوحة في درجة حرارة تتراوح بين 2 و8 درجات مئوية. لا تستخدم الكواشف بعد تاريخ انتهاء الصلاحية، أو إذا ظهرت عليها عكارة. قبل الاستخدام، اترك جميع الكواشف لتصل إلى درجة حرارة الغرفة (18-25 درجة مئوية). بعد الاستخدام مباشرة، أعدها إلى ظروف التخزين المناسبة. تبقى المعايير المجففة بالتجميد مستقرة حتى تاريخ انتهاء الصلاحية. بعد إعادة تكوين المحلول، قسّم المحلول القياسي مباشرةً إلى حصص في قوارير من البولي بروبيلين بمقدار 50 ميكرولتر لكل قارورة، ثم جمّدها عند درجة حرارة -80 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر. إذا لزم الأمر، خزّن المحلول في درجة حرارة تتراوح بين 2 و8 درجات مئوية لمدة تصل إلى 8 ساعات قبل تقسيمه إلى حصص وتجميده. لا تترك المحلول القياسي المُعاد تكوينه في درجة حرارة الغرفة.
إجراءات التحليل الموصى بها: المحاليل المنظمة الموصى بها. ملاحظة: لا تستخدم أزيد الصوديوم في هذه التحضيرات. يُعطّل أزيد الصوديوم إنزيم بيروكسيداز الفجل. يُوصى باستخدام مجموعة كواشف BD OptEIA™ B (رقم المنتج 550534) التي تحتوي على محلول التغطية، ومخفف التحليل، وكواشف الركيزة A وB، ومحلول الإيقاف، ومحلول غسيل مركز 20X. 1. محلول التغطية - كربونات الصوديوم 0.1 مولار، درجة الحموضة 9.5؛ 7.13 غرام من بيكربونات الصوديوم، 1.59 غرام من كربونات الصوديوم؛ يُكمل الحجم إلى 1.0 لتر؛ تُضبط درجة الحموضة إلى 9.5 باستخدام هيدروكسيد الصوديوم 10 مولار. يُحضر طازجًا أو يُستخدم خلال 7 أيام من التحضير، ويُخزن في درجة حرارة 2-8 درجة مئوية. 2. مخفف التحليل - محلول فوسفات ملحي* مع 10% مصل بقري جنيني#، درجة الحموضة 7.0. يُوصى باستخدام مُخفِّف اختبار BD Pharmingen™ (رقم المنتج 555213). *محلول ملحي مُخفَّف بالفوسفات: 80.0 غ كلوريد الصوديوم، 11.6 غ فوسفات ثنائي هيدروجين الصوديوم، 2.0 غ فوسفات ثنائي هيدروجين البوتاسيوم، 2.0 غ كلوريد البوتاسيوم، كمية كافية حتى 10 لترات؛ درجة الحموضة 7.0. #مصل جنيني بقري: يُوصى باستخدام Hyclone رقم المنتج SH30088 (مُنشَّط حراريًا). يُحضَّر طازجًا أو يُستخدم خلال 3 أيام من التحضير، ويُخزَّن في درجة حرارة 2-8 درجة مئوية. 3. محلول الغسل - محلول ملحي مُخفَّف بالفوسفات* مع 0.05% توين-20. يُحضَّر طازجًا أو يُستخدم خلال 3 أيام من التحضير، ويُخزَّن في درجة حرارة 2-8 درجة مئوية. 4. محلول الركيزة - رباعي ميثيل بنزيدين (TMB) وبيروكسيد الهيدروجين. يوصى باستخدام مجموعة كواشف ركيزة BD Pharmingen™ TMB (رقم المنتج 555214). 5. محلول الإيقاف - 1 مولار H3PO4 أو 2 مولار H2SO4. المواد الإضافية المطلوبة: 1. يوصى باستخدام صفائح BD Falcon™ ELISA ذات 96 بئرًا (رقم المنتج 353279). 2. قارئ صفائح دقيقة قادر على قياس الامتصاص عند 450 نانومتر. 3. ماصات دقيقة. 4. أسطوانة مدرجة سعة لتر واحد. 5. ماء منزوع الأيونات أو مقطر. 6. زجاجة غسيل أو غسالة آلية. 7. ورق رسم بياني لوغاريتمي أو معالجة آلية للبيانات. 8. أنابيب لتحضير التخفيفات القياسية. 9. مؤقت مختبري. 10. أغطية صفائح أو غشاء بارافين. جمع العينات ومعالجتها: يجب أن تكون العينات صافية، وغير متحللة الدم، وغير دهنية. السائل الطافي لمزارع الخلايا: أزل أي مواد جسيمية بالطرد المركزي، ثم قم بإجراء التحليل فورًا أو خزّن العينات عند درجة حرارة ≤ -20 درجة مئوية. تجنب دورات التجميد والذوبان المتكررة. المصل: استخدم أنبوب فصل المصل، واترك العينات تتخثر لمدة 30 دقيقة، ثم قم بالطرد المركزي لمدة 10 دقائق عند 1000 × g. أزل المصل وقم بإجراء التحليل فورًا أو خزّن العينات عند درجة حرارة ≤ -20 درجة مئوية. تجنب دورات التجميد والذوبان المتكررة. البلازما: اجمع البلازما باستخدام السترات أو EDTA أو الهيبارين كمضاد للتخثر. قم بالطرد المركزي لمدة 10 دقائق عند 1000 × g خلال 30 دقيقة من الجمع. قم بإجراء التحليل فورًا أو خزّن العينات عند درجة حرارة ≤ -20 درجة مئوية. تجنب دورات التجميد والذوبان المتكررة. تحضير المعايير والتعامل معها: 1. إعادة التكوين: بعد تسخين المعيار المجفف بالتجميد إلى درجة حرارة الغرفة، افتح القارورة بحرص لتجنب فقدان المادة. أعد تكوين المحلول القياسي المجفف بالتجميد بإضافة 1.0 مل من الماء منزوع الأيونات للحصول على محلول قياسي مركز. اترك المحلول القياسي حتى يصل إلى حالة التوازن لمدة 15 دقيقة على الأقل قبل إجراء التخفيفات. رجّ المحلول برفق باستخدام جهاز الرجّ. 2. تخزين/معالجة المحلول القياسي المُعاد تكوينه: بعد إعادة التكوين، قسّم المحلول القياسي المركز فورًا إلى أجزاء متساوية في قوارير بولي بروبيلين، 50 ميكرولتر لكل قارورة، ثم جمّدها عند درجة حرارة -80 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر. إذا لزم الأمر، خزّنها عند درجة حرارة 2-8 درجة مئوية لمدة تصل إلى 8 ساعات قبل تقسيمها إلى أجزاء متساوية وتجميدها. لا تترك المحلول القياسي المُعاد تكوينه في درجة حرارة الغرفة. 3. تحضير المحاليل القياسية للتحليل: أ. حضّر محلولًا قياسيًا بتركيز 1000 بيكوغرام/مل من المحلول القياسي المركز. رجّ المحلول جيدًا باستخدام جهاز الرجّ. (راجع تعليمات التخفيف في شهادة التعليمات/التحليل). ب. أضف 300 ميكرولتر من مخفف التحليل إلى 6 أنابيب. قم بتسمية العينات بالتركيزات التالية: 500 بيكوغرام/مل، 250 بيكوغرام/مل، 125 بيكوغرام/مل، 62.5 بيكوغرام/مل، 31.3 بيكوغرام/مل، و15.6 بيكوغرام/مل. ج. قم بإجراء تخفيفات متسلسلة بإضافة 300 ميكرولتر من كل معيار إلى الأنبوب التالي مع الخلط جيدًا بين كل عملية نقل. يُستخدم مخفف المعايرة كمعيار صفري (0 بيكوغرام/مل). تحضير كاشف العمل (ملاحظة: حضانة كواشف البيوتين/ستربتافيدين في خطوة واحدة). أضف الحجم المطلوب من جسم الكشف المضاد إلى مخفف المعايرة. في غضون 15 دقيقة قبل الاستخدام، أضف الكمية المطلوبة من كاشف الإنزيم، ثم اخلط جيدًا. للاطلاع على التخفيفات الموصى بها، راجع تعليمات/شهادة التحليل الخاصة بالدفعة. لتحضير صفيحة كاملة من 96 بئرًا، حضّر 12 مل من كاشف العمل. تخلص من أي كاشف عمل متبقٍ بعد الاستخدام. إجراء التحليل المفصل: 1. قم بتغطية الآبار الدقيقة بـ 100 ميكرولتر من الأجسام المضادة المُلتقطة المخففة في محلول التغطية. للاطلاع على التخفيف الموصى به لتغطية الأجسام المضادة، راجع التعليمات/شهادة التحليل الخاصة بالدفعة. أغلق الصفيحة بإحكام وحضّنها طوال الليل عند درجة حرارة 4 مئوية. 2. اسحب المحلول من الآبار واغسلها 3 مرات باستخدام 300 ميكرولتر أو أكثر من محلول الغسل لكل بئر. بعد الغسلة الأخيرة، اقلب الصفيحة وجففها بورق ماص لإزالة أي محلول متبقٍ. 3. قم بتغطية الصفائح بـ 200 ميكرولتر أو أكثر من مخفف التحليل لكل بئر. حضّنها في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. 4. اسحب المحلول واغسلها كما في الخطوة 2. 5. حضّر تخفيفات المعيار والعينة في مخفف التحليل. راجع "تحضير المعايير والتعامل معها". 6. ضع 100 ميكرولتر من كل معيار وعينة وعنصر تحكم في الآبار المناسبة باستخدام ماصة. أغلق الصفيحة بإحكام وحضّنها لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة. ٧. اسحب السائل/اغسل كما في الخطوة ٢، ولكن مع ٥ غسلات إجمالاً. ٨. أضف ١٠٠ ميكرولتر من كاشف العمل (جسم مضاد للكشف + كاشف SAv-HRP) إلى كل بئر. أغلق الصفيحة بإحكام وحضّنها لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. ٩. اسحب السائل/اغسل كما في الخطوة ٢، ولكن مع ٧ غسلات إجمالاً. ملاحظة: في خطوة الغسل الأخيرة هذه، انقع الآبار في محلول الغسل لمدة ٣٠ ثانية إلى دقيقة واحدة لكل غسلة. ١٠. أضف ١٠٠ ميكرولتر من محلول الركيزة إلى كل بئر. حضّن الصفيحة (بدون غطاء) لمدة ٣٠ دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام. ١١. أضف ٥٠ ميكرولتر من محلول الإيقاف إلى كل بئر. ١٢. اقرأ الامتصاص عند ٤٥٠ نانومتر في غضون ٣٠ دقيقة من إيقاف التفاعل. إذا كان تصحيح الطول الموجي متاحًا، فاطرح الامتصاص عند ٥٧٠ نانومتر من الامتصاص عند ٤٥٠ نانومتر. ملخص إجراء التحليل: 1. أضف 100 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة المخففة إلى كل بئر. حضّن لمدة ليلة كاملة عند درجة حرارة 4 مئوية. 2. اسحب المحلول واغسله 3 مرات. 3. في حالة حجب الصفائح: أضف 200 ميكرولتر من مخفف التحليل إلى كل بئر. حضّن لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. 4. اسحب المحلول واغسله 3 مرات. 5. أضف 100 ميكرولتر من المحلول القياسي أو العينة إلى كل بئر. حضّن لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة. 6. اسحب المحلول واغسله 5 مرات. 7. أضف 100 ميكرولتر من محلول الكاشف العامل (الأجسام المضادة للكشف + SAv-HRP) إلى كل بئر. حضّن لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. 8. اسحب المحلول واغسله 7 مرات (مع نقع لمدة 30 ثانية إلى دقيقة واحدة). 9. أضف 100 ميكرولتر من محلول الركيزة إلى كل بئر. حضّن لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام. 10. أضف 50 ميكرولتر من محلول الإيقاف إلى كل بئر. اقرأ عند 450 نانومتر خلال 30 دقيقة مع تصحيح الطول الموجي عند 570 نانومتر. حساب النتائج: احسب متوسط ​​الامتصاص لكل مجموعة من المعايير المكررة، وعينات التحكم، والعينات. اطرح متوسط ​​امتصاص المعيار الصفري من كل مجموعة. ارسم منحنى المعايرة على ورق رسم بياني لوغاريتمي، مع تركيز IL-5 على المحور السيني والامتصاص على المحور الصادي. ارسم منحنى أفضل مطابقة يمر بنقاط المعايير. لتحديد تركيز IL-5 في العينات المجهولة، أوجد متوسط ​​قيمة امتصاص العينة المجهولة على المحور الصادي وارسم خطًا أفقيًا إلى منحنى المعايرة. عند نقطة التقاطع، ارسم خطًا رأسيًا إلى المحور السيني واقرأ تركيز IL-5. إذا كانت العينات مخففة، اضرب تركيز IL-5 في عامل التخفيف. يمكن أيضًا استخدام معالجة البيانات الحاسوبية، باستخدام تحليل الانحدار اللوغاريتمي. التفاعل المتبادل الخاص: تم اختبار العوامل التالية في اختبار BD OptEIA™ عند ≥ 10 نانوغرام/مل ولم يتم تحديد أي تفاعل متبادل (قيمة ≥ 4 بيكوغرام/مل). الإنسان المؤتلف: IL-1α، IL-1β، IL-2، IL-3، IL-4، IL-5، IL-6، IL-7، IL-8، IL-9، IL-10، IL-11، IL- 12 (p40)، IL-12 (p70)، IL-13، IL-15، G-CSF، GM-CSF، IFN-γ، CD23، Lymphotactin، MIP-1α، MIP-1β، MCP-1، MCP-2، NT-3، PDGF-AA، SCF، TNF، LT-α (TNF-β)، VEGF Recombinant Mouse: IL-1β، IL-2، IL-3، IL-4، IL-6، IL-7، IL-9، IL-10، إيل-12 (p70)، IL-15، IFN-γ، GM-CSF، MCP-1، TCA3، TNF (فئران مُعاد تركيبها): IL-2، IL-4، IL-6، IL-10، GM-CSF، IFN-γ، TNF (أخرى): IL-10 الفيروسي (1 نانوغرام/مل)، TNF (أرانب). قيود الإجراء: • يجب تخفيف العينات التي تُظهر قيم امتصاص أعلى من منحنى المعايرة باستخدام مُخفف المعايرة القياسي وإعادة تحليلها. • لم يتم التحقق بشكل كامل من تداخل مستقلبات الدواء أو المستقبلات الذائبة أو بروتينات الربط الأخرى في العينات. لا يمكن استبعاد احتمال حدوث تداخل. • مجموعات BD OptEIA™ مُصممة للاستخدام كوحدة متكاملة. لا تخلط الكواشف من دفعات مجموعات مختلفة. لا يُنصح باستخدام كواشف من مُصنّعين آخرين في هذه المجموعة.
إشعارات المنتج: للحصول على تدريب عبر الإنترنت حول تقنيات ELISA لمجموعة BD OptEIA™، يُرجى الرجوع إلى الرابط التالي: http://www.bdbiosciences.com/OptEIA/downloads.shtml. يجب تخفيف العينات التي تُظهر قيم امتصاص أعلى من منحنى المعايرة باستخدام مُخفف المعايرة القياسي وإعادة تحليلها. لم يتم التحقق بشكل كامل من تداخل مستقلبات الأدوية أو المستقبلات الذائبة أو بروتينات الربط الأخرى في العينات. لا يمكن استبعاد احتمال حدوث تداخل. صُممت مجموعات BD OptEIA™ للاستخدام كوحدة متكاملة. لا تخلط الكواشف من دفعات مختلفة من المجموعة. لا يُنصح باستخدام كواشف من شركات مصنعة أخرى في هذه المجموعة. قد تكون الكواشف التي تحتوي على مواد حافظة سامة في حالة الابتلاع أو الاستنشاق أو ملامسة الجلد. تعامل مع جميع عينات المصل والبلازما وفقًا لإرشادات NCCLS لمنع انتقال العدوى المنقولة بالدم. تحذير: ينتج أزيد الصوديوم حمض الهيدرازويك شديد السمية في الظروف الحمضية. خفف مركبات الأزيد بالماء الجاري قبل التخلص منها لتجنب تراكم رواسب قابلة للانفجار في أنابيب الصرف الصحي. مصدر جميع بروتينات المصل هو مسالخ معتمدة من وزارة الزراعة الأمريكية تقع في الولايات المتحدة. ProClin هي علامة تجارية لشركة Rohm and Haas.
الوصف: الكمية/الحجم: رقم القطعة: معرف EntrezGene
غير متوفر : لا شيء : غير متوفر : غير متوفر