كياجين، L6010L، إنزيم ربط الحمض النووي T3 (900,000 وحدة)

900,000 وحدة من إنزيم T3 DNA Ligase (3,000,000 وحدة/مل) ومحلول الربط السريع 2x

سمات

- يربط بين النهايات غير الحادة والنهايات المتماسكة
- يُصلح الشقوق أحادية السلسلة في الحمض النووي المزدوج
- يحفز تكوين رابطة فوسفاتية ثنائية الإستر بين مجموعة الفوسفات 5' ومجموعة الهيدروكسيل 3' في الحمض النووي المزدوج
- زيادة تحمل الملح مقارنةً بإنزيم T4 DNA Ligase

تفاصيل المنتج

يحفز إنزيم T3 DNA Ligase تكوين رابطة فوسفاتية ثنائية الإستر بين مجموعة الفوسفات 5' ومجموعة الهيدروكسيل 3' في الحمض النووي المزدوج. يربط هذا الإنزيم النهايات غير المتداخلة والنهايات المتماسكة، ويصلح الشقوق في الحمض النووي المزدوج أحادي السلسلة. في غياب 20-30% من بولي إيثيلين جلايكول 6000، يُظهر إنزيم T3 DNA Ligase كفاءة منخفضة جدًا في ربط النهايات غير المتداخلة. يتميز هذا الإنزيم بكفاءة أعلى في ربط النهايات المتدلية من نوع A وT مقارنةً بالنهايات المتطابقة من نوع C وG. يحتفظ إنزيم T3 DNA Ligase بنسبة 95% من نشاطه في محلول كلوريد الصوديوم أو كلوريد البوتاسيوم بتركيز 1.0 مولار، مع تركيز مثالي يبلغ 300 ملي مولار، مما يجعله الإنزيم الأمثل للتفاعلات التي تتطلب تركيزات ملحية عالية.

يتم توفير هذا الإنزيم في 20 ملي مولار من Tris-HCl، و300 ملي مولار من NaCl، و1 ملي مولار من DTT، و0.1 ملي مولار من EDTA، و50% من الجلسرين؛ درجة الحموضة 7.5 عند 25 درجة مئوية.

يحتوي محلول الربط السريع 2x على ما يلي: 132 ملي مولار Tris-HCl، 20 ملي مولار MgCl2، 2 ملي مولار DTT، 2 ملي مولار ATP عند 15% PEG 6000؛ درجة الحموضة 7.6 عند 25 درجة مئوية.

أداء

الاختبار: الوحدات المختبرة
النقاء: غير متوفر
النشاط المحدد: غير متوفر
إكسونوكلياز أحادي السلسلة: 30,000 وحدة
إنزيم إكسونوكلياز مزدوج السلسلة: 30,000 وحدة
إنزيم نوكلياز مزدوج السلسلة: 30,000 وحدة
تلوث الحمض النووي لبكتيريا الإشريكية القولونية: 30000 وحدة

- درجة حرارة التخزين: من -25 درجة مئوية إلى -15 درجة مئوية
- الوزن الجزيئي: 37350 دالتون

مبدأ

يتم إنتاج البروتين الإنزيمي المؤتلف بواسطة سلالة من بكتيريا الإشريكية القولونية المؤتلفة التي تحمل جين T3 DNA Ligase.

تُعرَّف الوحدة الواحدة بأنها كمية إنزيم T3 DNA Ligase اللازمة لربط 50% من 100 نانوغرام من شظايا الحمض النووي ذات النهايات المتماسكة في 30 دقيقة عند درجة حرارة 23 درجة مئوية.

إجراء

- 10 ميكرولتر من محلول الربط السريع 2x (B1010)
- 50 نانوغرام من الحمض النووي الناقل
- زيادة مولية بمقدار 3 أضعاف من الحمض النووي المُدخل
- 1 ميكرولتر من إنزيم ربط الحمض النووي T3 (L6010)
- ماء خالٍ من النيوكلياز حتى 20 ميكرولتر

- درجة الحموضة المثلى: 8.0
- درجة حرارة التفاعل المثلى: 20 درجة مئوية
- وقت التفاعل الأمثل: >30 دقيقة (بدون PEG 6000)
- القوة الأيونية المثلى: 300 ملي مولار من كلوريد الصوديوم
- التركيز الأمثل للأيون ثنائي التكافؤ: 2 ملي مولار من المغنيسيوم (Mg²⁺)
- العامل المساعد الأمثل: ATP (0.5 ملي مولار)

تعليمات الاستخدام

ربط الطرف اللاصق للناقل المقطوع والإدخال.

النسبة المولية الموصى بها للحمض النووي، الناقل: الإدخال = 1: 3

1. قم بإعداد خليط التفاعل التالي بحجم إجمالي قدره 20 ميكرولتر (أضف الليغاز أخيرًا):

2. قم بحضانة خليط التفاعل عند درجة حرارة 25 درجة مئوية لمدة 15-30 دقيقة.

3. اترك الناتج المربوط على الجليد، ثم انقل 1-5 ميكرولتر من الناتج إلى 50 ميكرولتر من الخلايا المؤهلة. بدلاً من ذلك، يمكن تنقية ناتج الربط باستخدام الطريقة المناسبة أو تخزينه عند درجة حرارة -20 درجة مئوية.

ملحوظات

1. يُزوَّد إنزيم T3 DNA Ligase بمحلول ربط سريع بتركيز 2x لاستخدامه في تفاعلات الربط. يكون نشاطه منخفضًا جدًا في غياب البولي إيثيلين جلايكول (PEG) (1).

2. يؤدي التعطيل الحراري إلى تقليل كفاءة التحويل بشكل كبير.

وقد تم أيضًا توصيف الإنزيم في محلول T3 DNA Ligase Buffer 1x، مع انخفاض بمقدار 17 ضعفًا في النشاط المحدد بسبب غياب عامل الازدحام (PEG 6000).

يحتوي محلول T3 DNA Ligase Buffer 1x على 50 ملي مولار Tris-HCl، و300 ملي مولار NaCl، و0.5 ملي مولار ATP و1 ملي مولار DTT؛ درجة الحموضة 8.0 عند 25 درجة مئوية.

تم أخذ المعلومات التالية من مرجع Cai (Cai, Liang, et al. (2004) J. Biochem. 135:397)، والذي يصف خصائص إنزيم T3 DNA Ligase:

ضبط الجودة

تم قياس نشاط الوحدة باستخدام طريقة التخفيف التسلسلي الثنائي. تم تحضير تخفيفات الإنزيم في محلول الربط السريع 1x، وأضيفت إلى تفاعلات حجمها 20 ميكرولتر تحتوي على قطع من الحمض النووي المزدوج ومحلول الربط السريع 1x. حُضنت التفاعلات لمدة 30 دقيقة عند درجة حرارة 23 درجة مئوية، ثم وُضعت على الجليد وحُللت على هلام أجاروز بنسبة 1% مُلَوَّن ببروميد الإيثيديوم.

يتم تحديد تركيز البروتين عن طريق قياس الامتصاص عند 280 نانومتر.

يتم تقييم النقاء الفيزيائي باستخدام تقنية الفصل الكهربائي الهلامي SDS-PAGE لمحاليل الإنزيم المركزة والمخففة، متبوعةً بالكشف باستخدام صبغة الفضة. ويُقاس النقاء بمقارنة الكتلة الإجمالية لحزم الملوثات في العينة المركزة بكتلة الحزمة المقابلة للبروتين المطلوب في العينة المخففة.

يتم تحديد الإكسونوكلياز أحادي السلسلة في تفاعل حجمه 50 ميكرولتر يحتوي على ركيزة DNA أحادية السلسلة موسومة إشعاعيًا و10 ميكرولتر من محلول الإنزيم الذي يتم تحضينه لمدة 4 ساعات عند 37 درجة مئوية.

يتم تحديد نشاط الإكسونوكلياز ثنائي السلسلة في تفاعل 50 ميكرولتر يحتوي على ركيزة DNA ثنائية السلسلة موسومة إشعاعيًا و10 ميكرولتر من محلول الإنزيم الذي يتم تحضينه لمدة 4 ساعات عند 37 درجة مئوية.

يتم تحديد نشاط الإندونوكلياز ثنائي السلسلة في تفاعل 50 ميكرولتر يحتوي على 0.5 ميكروغرام من الحمض النووي البلازميدي و10 ميكرولتر من محلول الإنزيم الذي يتم تحضينه لمدة 4 ساعات عند 37 درجة مئوية.

يتم تقييم التلوث ببكتيريا الإشريكية القولونية باستخدام عينات مكررة بحجم 5 ميكرولتر من محلول الإنزيم الذي يتم فصله وفحصه في اختبار TaqMan qPCR للكشف عن وجود الحمض النووي الجينومي الملوث ببكتيريا الإشريكية القولونية باستخدام بادئات قليلة النوكليوتيدات المقابلة لموقع 16S rRNA.

التطبيقات

- ربط الاستنساخ
- إغلاق الشقوق في الحمض النووي المزدوج

هذا المنتج متوفر لتطبيقات البيولوجيا الجزيئية مثل:

مراجع

1. كاي، L. وآخرون. (2004) جي. الكيمياء الحيوية.، 135، 397-403.