CST، 11953S، SimpleChIP® بادئات الإنترون 3 لجين EGR1 البشري

مجموعة تمهيدية لدراسة EGR1 في مجال البحث. معلومات استخدام المنتج ١. ضع علامة على العدد المناسب من أنابيب أو صفائح تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) المتوافقة مع طراز جهاز تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي (Real-time PCR) المستخدم. يجب إجراء تفاعلات PCR مرتين، ويجب أن تتضمن أنبوبًا خاليًا من الحمض النووي للتحكم في التلوث، وتخفيفًا متسلسلًا لـ ٢٪ من إجمالي الحمض النووي للكروماتين المدخل (غير مخفف، ١:٥، ١:٢٥، ١:١٢٥)، والذي يُستخدم لإنشاء منحنى معياري وتحديد كفاءة التضخيم. ٢. أضف ٢ ميكرولتر من عينة الحمض النووي ChIP المناسبة إلى كل أنبوب أو بئر في صفيحة PCR. ٣. حضّر مزيج تفاعل PCR الرئيسي كما هو موضح أدناه. أضف كمية كافية من الكواشف لتفاعلين إضافيين لتعويض فقدان الحجم. أضف ١٨ ميكرولتر من مزيج تفاعل PCR الرئيسي إلى كل أنبوب أو بئر في صفيحة PCR. حجم الكواشف لتفاعل PCR واحد (20 ميكرولتر): ماء خالٍ من النيوكلياز 6 ميكرولتر، بادئات SimpleChIP® بتركيز 5 ميكرومولار 2 ميكرولتر، مزيج تفاعل SYBR® Green بتركيز 2X 10 ميكرولتر. 4. ابدأ برنامج تفاعل PCR التالي: أ. التفكك الأولي: 95 درجة مئوية لمدة 3 دقائق. ب. التفكك: 95 درجة مئوية لمدة 15 ثانية. ج. التلدين والاستطالة: درجة حرارة خاصة بكل بادئ لمدة 60 ثانية. د. كرر الخطوتين ب وج لمدة 40 دورة. 5. حلل نتائج تفاعل PCR الكمي باستخدام البرنامج المرفق بجهاز PCR في الوقت الحقيقي. تخزين يُقدّم المنتج في ماء خالٍ من النيوكلياز بتركيز 5 ميكرومولار (يبلغ التركيز النهائي لكل بادئ 5 ميكرومولار). يُحفظ في درجة حرارة -20 درجة مئوية. بروتوكول البروتوكولات المتاحة: ترسيب الكروماتين المناعي النوعية / الحساسية التفاعل مع الأنواع: الإنسان خلفية يُعدّ اختبار الترسيب المناعي للكروماتين (ChIP) تقنيةً فعّالةً ومتعددة الاستخدامات لدراسة تفاعلات البروتين مع الحمض النووي (DNA) ضمن سياق الكروماتين الطبيعي للخلية (1، 2). يُمكن استخدام هذا الاختبار لتحديد العديد من البروتينات المرتبطة بمنطقة مُحددة من الجينوم، أو لتحديد المناطق المتعددة من الجينوم التي يرتبط بها بروتين مُعين (3-6). يُمكن استخدام ChIP لتحديد الترتيب المُحدد لاستقطاب البروتينات المختلفة إلى مُحفز الجين، أو لقياس الكمية النسبية لتعديل هيستون مُعين عبر موقع جيني كامل (3، 4). بالإضافة إلى بروتينات الهيستون، يُمكن استخدام اختبار ChIP لتحليل ارتباط عوامل النسخ والعوامل المُساعدة، وعوامل تضاعف الحمض النووي، وبروتينات إصلاح الحمض النووي. عند إجراء اختبار ChIP، تُثبّت الخلايا أولاً بالفورمالديهايد، وهو عامل ربط عكسي بين البروتين والحمض النووي، يحافظ على تفاعلات البروتين مع الحمض النووي التي تحدث في الخلية (1، 2). تُحلل الخلايا ويُستخلص الكروماتين ويُجزأ باستخدام الموجات فوق الصوتية أو الهضم الأنزيمي. ثم يُخضع الكروماتين المجزأ لعملية ترسيب مناعي باستخدام أجسام مضادة نوعية لبروتين معين أو تعديل هيستوني محدد. أي تسلسلات DNA مرتبطة بالبروتين أو التعديل الهيستوني محل الاهتمام ستترسب مع الكروماتين كجزء من المركب الكروماتيني المتشابك، وستزداد كمية هذا التسلسل DNA نسبيًا من خلال عملية الانتقاء المناعي. بعد الترسيب المناعي، تُفك روابط البروتين-DNA ويُنقى DNA. غالبًا ما يُستخدم تفاعل البوليميراز المتسلسل القياسي (PCR) أو تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الحقيقي (qPCR) لقياس مقدار زيادة تسلسل DNA معين بواسطة الترسيب المناعي النوعي للبروتين (1،2). بدلاً من ذلك، يمكن دمج اختبار ChIP مع تقنيات المصفوفات الدقيقة لتسلسل الجينوم (ChIP on chip)، أو التسلسل عالي الإنتاجية (ChIP-Seq)، أو استراتيجيات الاستنساخ، وكلها تتيح تحليلًا شاملًا للجينوم لتفاعلات البروتين مع الحمض النووي وتعديلات الهيستون (5-8). وقد تم تحسين بادئات SimpleChIP لتضخيم الحمض النووي المعزول بتقنية ChIP باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الحقيقي، وتوفر ضوابط إيجابية وسلبية مهمة يمكن استخدامها لتأكيد نجاح تجربة ChIP. مواصفة التفاعل: H