CST، 59524S، PTMScan®، ببتيدات التحكم، إثراء الفوسفور، IMAC

مستخلصات الخلايا للدراسة في مجال البحث. معلومات استخدام المنتج يُستخدم مع مجموعة PTMScan® Phospho-Enrichment IMAC Fe-NTA Magnetic Beads #20432 من شركة Cell Signaling Technology، وفقًا لبروتوكول خطوة الحضانة. نظرًا لأن الكمية المثلى من PTMScan® Control Peptides Phospho-Enrichment IMAC لتجارب كل مستخدم تعتمد على عوامل خاصة، مثل حساسية مطياف الكتلة، يمكن للمستخدمين تخفيف هذه الببتيدات الضابطة حسب الحاجة في المذيب المناسب. 1. قسّم PTMScan® Control Peptides Phospho-Enrichment IMAC إلى حصص صغيرة للتخزين كوحدات للاستخدام الفردي عند درجة حرارة -20 درجة مئوية، أو استخدمها مباشرةً. 2. قم بإجراء هضم ثانوي بالتربسين لببتيدات العينة في المحلول المنظم والحجم المناسبين لمدة ساعتين عند درجة حرارة 37 درجة مئوية، على سبيل المثال، 50 ميكرولتر من محلول منظم يحتوي على 5% أسيتونيتريل، و50 ملي مولار بيكربونات الأمونيوم، و100 نانوغرام/ميكرولتر من التربسين. 3. أضف 0.95 مل من محلول التحميل (0.1% حمض ثلاثي فلورو أسيتيك، 85% أسيتونيتريل) إلى المحلول المُهضّم، ثمّ رجّه جيدًا. 4. صفِّ ببتيدات العينة بالطرد المركزي. 5. انقل ببتيدات العينة المصفاة إلى أنابيب تحتوي على خرز مغناطيسي IMAC مغسول. 6. أضف 10 ميكرولتر من PTMScan® Control Peptides Phospho-Enrichment IMAC إلى الأنابيب التي تحتوي على الخرز وببتيدات العينة، واخلط جيدًا. 7. تابع سير عمل IMAC عند خطوة الحضانة لمدة 30 دقيقة. 8. اكشف عن PTMScan® Control Peptides Phospho-Enrichment IMAC في ملف بيانات LCMS. تخزين هذا المنتج مستقر لمدة 24 شهرًا عند تخزينه في درجة حرارة -20 درجة مئوية. يُنصح بتقسيمه إلى حصص صغيرة لتجنب دورات التجميد والذوبان المتكررة. خلفية تُستخدم تقنية كروماتوغرافيا تقارب المعادن المُثبَّتة (IMAC) على نطاق واسع لإثراء البروتينات والببتيدات من العينات البيولوجية عن طريق الارتباط بمجموعات من الشحنات السالبة. تُستخدم أيونات المعادن الانتقالية ثنائية التكافؤ، مثل الكوبالت والنحاس والنيكل والزنك، بشكل شائع لتنقية البروتينات الغنية بالهيستيدين المتعدد أو السيستين، بالإضافة إلى البروتينات ذات الألفة للمعادن. أما أيونات المعادن ثلاثية التكافؤ، مثل الحديد والغاليوم والألومنيوم، بالإضافة إلى التيتانيوم والزركونيوم، فتُستخدم عادةً لإثراء الببتيدات الفوسفورية في الدراسات البروتينية (1). يُستخدم حمض الإيمينوداياسيتيك (IDA) أو حمض النيتريلوترياسيتيك (NTA) لربط أيونات المعادن بخرزات مغلفة بالأغاروز. وقد أظهرت الدراسات المقارنة أن NTA يتفوق على IDA في الانتقاء والتعرف على عدد أكبر من الببتيدات الفوسفورية. أما الغاليوم والحديد، فهما متقاربان من حيث عدد الببتيدات الفوسفورية التي تم تحديدها (2). بالمقارنة مع كروماتوغرافيا تقارب أكسيد المعادن (MOAC) باستخدام ثاني أكسيد التيتانيوم (TiO₂)، أظهرت كروماتوغرافيا تقارب الحديد (Fe IMAC) أداءً أفضل بشكل طفيف، حيث يُفضل ثاني أكسيد التيتانيوم الببتيدات الفوسفورية الحمضية (pI > 4) مقارنةً بالحديد الذي يُفضل الببتيدات الأقل حمضية (pI < 4) (3). تُوفر خرزات PTMScan Phospho-Enrichment IMAC Fe-NTA المغناطيسية #20432 أداة فعالة لإثراء الببتيدات الفوسفورية مع تحيز ضئيل أو معدوم لسياق بقايا الفوسفور. يُمكن استخدامها بشكل مستقل أو بالتزامن مع الإثراء القائم على التقارب المناعي لاستكمال أي دراسة بروتينية باستخدام PTMScan LC-MS/MS.