BD، 557793، مجموعة إثراء الخلايا اللمفاوية التائية للفئران BD IMag™-DM

التطبيق: فصل الخلايا (يتم اختباره بشكل روتيني)
الوضع التنظيمي: للاستخدام البحثي فقط
RRID: AB_2869096
الوصف: تُستخدم مجموعة BD IMag™ Mouse T Lymphocyte Enrichment Set - DM للاختيار السلبي للخلايا اللمفاوية التائية من طحال أو عقدة لمفاوية للفأر. يحتوي كوكتيل Biotinylated Mouse T Lymphocyte Enrichment Cocktail على أجسام مضادة وحيدة النسيلة تتعرف على المستضدات الموجودة على كريات الدم الحمراء والبيضاء الطرفية التي ليست خلايا لمفاوية تائية. أما جزيئات BD IMag™ Streptavidin Particles Plus - DM فهي جزيئات نانوية مغناطيسية مرتبطة تساهميًا بالستربتافيدين على أسطحها. بفضل هذين المكونين، تتجنب مجموعة BD IMag™ Mouse T Lymphocyte Enrichment Set - DM التنشيط غير المقصود للخلايا اللمفاوية التائية المُثرية، وذلك باستخدام كواشف لا ترتبط مباشرةً بتلك الخلايا التائية. تم تحسين هذه المجموعة للاستخدام مع مغناطيس فصل الخلايا BD IMag™، وتحتوي على كمية كافية من الكواشف لوسم 10^9 من الكريات البيضاء. يتكون مزيج إثراء الخلايا اللمفاوية التائية للفئران المُؤشَّرة بالبيوتين من الأجسام المضادة وحيدة النسيلة التالية المُقترنة بالبيوتين: مضاد CD11b للفئران، المستنسخ M1/70؛ مضاد CD45R/B220 للفئران، المستنسخ RA3-6B2؛ مضاد CD49b للفئران، المستنسخ HMα2؛ مضاد TER-119/الخلايا الحمراء للفئران، المستنسخ TER-119
التحضير والتخزين: يُحفظ غير مخفف عند درجة حرارة 4 درجات مئوية. تم تنقية الجسم المضاد أحادي النسيلة من سائل مزرعة الأنسجة أو السائل الاستسقائي باستخدام كروماتوغرافيا التقارب. تم ربط الجسم المضاد بالبيوتين في ظل الظروف المثلى، وتمت إزالة البيوتين غير المتفاعل. تم ربط الجسم المضاد أو الستربتافيدين بالجسيمات المغناطيسية في ظل الظروف المثلى، وتمت إزالة الجسم المضاد/الستربتافيدين غير المرتبط.
إجراءات الفحص الموصى بها: فيما يلي بروتوكول الوسم المغناطيسي والإثراء المفصل. باختصار، يقوم مزيج إثراء الخلايا اللمفاوية التائية للفئران المبيوتينية بتلوين كريات الدم الحمراء ومعظم كريات الدم البيضاء باستثناء الخلايا اللمفاوية التائية. بعد غسل الأجسام المضادة الزائدة، تُضاف جزيئات BD IMag™ Streptavidin Particles Plus - DM إلى معلق الخلايا، حيث ترتبط بالخلايا الحاملة للأجسام المضادة المبيوتينية. ثم يُوضع الأنبوب الذي يحتوي على معلق الخلايا الموسوم داخل المجال المغناطيسي لجهاز فصل الخلايا المغناطيسي BD IMag™ (رقم المنتج 552311). بعد ذلك، تُجرى عملية اختيار سلبي لإثراء الخلايا التائية غير الموسومة. تهاجر الخلايا الموسومة نحو المغناطيس (الجزء الموجب)، تاركةً الخلايا غير الموسومة في المعلق ليتم سحبها والاحتفاظ بها (الجزء المُثرى). تُكرر عملية الاختيار السلبي مرتين لزيادة كمية الجزء المُثرى. في حال الحاجة إلى نقاء أعلى، يمكن إجراء عملية اختيار سلبي على الجزء المُثرى. تم توضيح خطوات الفصل المغناطيسي في مخطط تدفق الإثراء. يمكن تقييم الأجزاء الموجبة والمُثرية في تطبيقات لاحقة مثل قياس التدفق الخلوي وزراعة الأنسجة. تم تحسين الأجسام المضادة في كوكتيل إثراء الخلايا اللمفاوية التائية للفئران المُؤشَّرة بالبيوتين وتخفيفها مسبقًا لزيادة كفاءة إثراء الخلايا اللمفاوية التائية من الأعضاء اللمفاوية الطرفية. بروتوكول الوسم والإثراء المغناطيسي 1. يمكن إجراء جميع خطوات الوسم والإثراء إما في وسط زراعة الأنسجة* أو في محلول BD IMag™ المعقم بتركيز 1X. - بالنسبة لمحلول BD IMag™ بتركيز 1X: خفف محلول BD IMag™ (10X) (رقم المنتج 552362) بنسبة 1:10 باستخدام ماء مقطر معقم أو حضّر محلول ملحي مُخفَّف بالفوسفات مُدعَّم بـ 0.5% من ألبومين المصل البقري، و2 ملي مول من حمض الإيثيلين ديامين رباعي الأسيتيك، و0.1% من أزيد الصوديوم. ٢. حضّر معلقًا خلويًا أحاديًا من النسيج اللمفاوي المحيطي المطلوب، مع مراعاة التعقيم. أزل تجمعات الخلايا و/أو الحطام بتمرير الخلايا المعلقة عبر مصفاة خلايا من النايلون بمسام ٧٠ ميكرومتر. يمكن تحضير المعلقات الخلوية في وسط زراعة الأنسجة* أو محلول BD IMag™ بتركيز ١X. ٣. عدّ الخلايا. إذا كان التركيز بين ١٠ × ١٠^٦ و ٢٠ × ١٠^٦ خلية/مل، فانتقل إلى الخطوة ٤. إذا كانت الخلايا مخففة أكثر، فقم بفصلها بالطرد المركزي وأعد تعليقها في وسط زراعة الأنسجة* أو محلول BD IMag™ بتركيز ١X عند تركيز ٢٠ × ١٠^٦ خلية/مل. ٤. أضف ٥ ميكرولتر من مزيج إثراء الخلايا اللمفاوية التائية الفأرية المُعَلَّمة بيولوجيًا لكل ١ × ١٠^٦ خلية، وحضّنها على الجليد لمدة ١٥ دقيقة.† ٥. اغسل الخلايا المُعَلَّمة بعشرة أضعاف حجم وسط زراعة الأنسجة* أو محلول BD IMag™ المُعَلَّم بتركيز ١X، ثم قم بالطرد المركزي عند ٣٠٠ × جم لمدة ٧ دقائق، واسحب كل السائل الطافي بعناية. ٦. رجّ جزيئات BD IMag™ Streptavidin Particles Plus - DM جيدًا، وأضف ٥ ميكرولتر من الجزيئات لكل ١ × ١٠^٦ خلية إجمالية. ٧. اخلط جيدًا. ضعها في الثلاجة لمدة ٣٠ دقيقة عند درجة حرارة ٦-١٢ درجة مئوية.† ٨. ارفع تركيز الوسم إلى ٢٠-٨٠ × ١٠^٦ خلية/مل باستخدام وسط زراعة الأنسجة* أو محلول BD IMag™ المُعَلَّم بتركيز ١X. ٩. انقل الخلايا الموسومة إلى أنبوب اختبار ذي قاع مستدير بأبعاد ١٢ × ٧٥ مم، بحيث لا يتجاوز الحجم المضاف ١.٠ مل. ضع أنبوب الجزء الموجب هذا على مغناطيس فصل الخلايا (في الوضع الأفقي) لمدة ٦ إلى ٨ دقائق.† - للحصول على حجم أكبر، انقل الخلايا إلى أنبوب اختبار ذي قاع مستدير بأبعاد ١٧ × ١٠٠ مم، بحيث لا يتجاوز الحجم المضاف ٣.٠ مل. ضع أنبوب الجزء الموجب هذا على مغناطيس فصل الخلايا (في الوضع الرأسي) لمدة ٨ دقائق.† ١٠. مع بقاء الأنبوب على مغناطيس فصل الخلايا، وباستخدام ماصة باستور زجاجية معقمة، اسحب السائل الطافي (الجزء المُخصب) بعناية وضعه في أنبوب معقم جديد. ١١. أخرج أنبوب الجزء الموجب من جهاز فصل الخلايا المغناطيسي، وأضف وسط زراعة الأنسجة* أو محلول BD IMag™ بتركيز 1X بنفس الحجم كما في الخطوة ٨. أعد تعليق الجزء الموجب جيدًا عن طريق سحب المحلول ودفعه بالماصة من ١٠ إلى ١٥ مرة، ثم أعد الأنبوب إلى جهاز فصل الخلايا المغناطيسي لمدة ٦ إلى ٨ دقائق.† - بالنسبة لأنبوب ١٧ × ١٠٠ مم: ضعه على جهاز فصل الخلايا المغناطيسي لمدة ٨ دقائق.† ١٢. باستخدام ماصة باستور معقمة جديدة، اسحب السائل الطافي بحرص واخلطه مع الجزء المُخصب من الخطوة ١٠ أعلاه. ١٣. كرر الخطوتين ١١ و١٢. يحتوي الجزء المُخصب المُدمج على خلايا ليمفاوية تائية بدون أجسام مضادة أو جزيئات مغناطيسية مرتبطة بها. هذه الخلايا جاهزة للتطبيقات اللاحقة، أو يمكن زيادة تركيزها بالانتقال إلى الخطوة 15. 14. يمكن إعادة تعليق خلايا الجزء الموجب المتبقية في الأنبوب الأصلي في محلول منظم أو وسط زراعة مناسب للتطبيقات اللاحقة، بما في ذلك قياس التدفق الخلوي، إذا لزم الأمر. 15. لزيادة نقاء الجزء المُركّز بنسبة 3% إلى 5% إضافية (قارن بين اللوحتين الوسطى اليسرى واليمنى في الشكل)، ضع الأنبوب الذي يحتوي على الجزء المُركّز على مغناطيس فصل الخلايا لمدة 6 إلى 8 دقائق أخرى.† - بالنسبة لأنبوب 17 × 100 مم: ضعه على مغناطيس فصل الخلايا لمدة 8 دقائق.† 16. اسحب السائل الطافي بعناية وضعه في أنبوب معقم جديد. هذا هو الجزء المُركّز مرتين. الخلايا جاهزة للمعالجة للتطبيقات اللاحقة. 17. يجب تحليل عينات من معلق الخلايا الكلي والأجزاء الموجبة والمُركّزة بواسطة قياس التدفق الخلوي لتقييم كفاءة إجراء فصل الخلايا. ملاحظات: * تحتوي بعض أوساط زراعة الأنسجة على البيوتين، الذي قد يتداخل مع ارتباط جزيئات الستربتافيدين. نوصي باستخدام وسط دولبيكو الأساسي الأدنى (DMEM). † تجنب الوسم غير المحدد بالعمل بسرعة والالتزام بأوقات الحضانة الموصى بها.
إشعارات المنتج: تُحضّر جزيئات BD IMag™ من جزيئات مغناطيسية مُعدّلة بمجموعات الكربوكسيل، تُصنّعها شركة Skold Technology بموجب ترخيص براءة الاختراع الأمريكية رقم 7,169,618. تحذير: يُنتج أزيد الصوديوم حمض الهيدرازويك شديد السمية في الظروف الحمضية. لذا، يُرجى تخفيف مركبات الأزيد بالماء الجاري قبل التخلص منها لتجنب تراكم رواسب قابلة للانفجار في أنابيب الصرف الصحي. يُرجى مراجعة www.bdbiosciences.com/us/s/resources للاطلاع على البروتوكولات الفنية. نظرًا لاختلاف التطبيقات، ينبغي على كل باحث معايرة الكاشف للحصول على أفضل النتائج. مصدر جميع بروتينات المصل هو مسالخ معتمدة من وزارة الزراعة الأمريكية، وتقع في الولايات المتحدة.
الوصف: معرف EntrezGene
غير متاح : غير متاح