BD، 557874، مجموعة إثراء الخلايا اللمفاوية التائية البشرية BD IMag™-DM

الوضع التنظيمي: للاستخدام البحثي فقط
RRID: AB_2869103
الوصف: تُستخدم مجموعة BD IMag™ Human T Lymphocyte Enrichment Set - DM للاختيار السلبي للخلايا اللمفاوية التائية من الدم المحيطي. يحتوي كوكتيل Biotin Human T Lymphocyte Enrichment Cocktail على أجسام مضادة وحيدة النسيلة تتعرف على المستضدات الموجودة على كريات الدم الحمراء والصفائح الدموية وكريات الدم البيضاء المحيطية التي ليست خلايا لمفاوية تائية. أما جزيئات BD IMag™ Streptavidin Particles Plus - DM فهي جزيئات نانوية مغناطيسية مرتبطة تساهميًا بالستربتافيدين على أسطحها. بفضل هذين المكونين، تتجنب مجموعة BD IMag™ Human T Lymphocyte Enrichment Set - DM التنشيط غير المقصود للخلايا اللمفاوية التائية المُثرية، وذلك باستخدام كواشف لا ترتبط مباشرةً بتلك الخلايا التائية. تم تحسين هذه المجموعة للاستخدام مع مغناطيس فصل الخلايا BD IMag™، وتحتوي على كمية كافية من الكواشف لوسم 10^9 خلية أحادية النواة في الدم المحيطي (PBMC). يتكون مكون كوكتيل إثراء الخلايا اللمفاوية التائية من الأجسام المضادة وحيدة النسيلة المرتبطة بالبيوتين التالية: مضاد CD11b/Mac-1 البشري (CR3)، المستنسخ ICRF44، مضاد CD16 البشري، المستنسخ 3G8، مضاد CD19 البشري، المستنسخ HIB19، مضاد CD36 البشري، المستنسخ CB38 (NL07)، مضاد CD41a البشري، المستنسخ HIP8، مضاد CD56 البشري، المستنسخ B159، مضاد CD235a البشري (جليكوبروتين أ)، المستنسخ GA-R2 (HIR2).
التحضير والتخزين: يُحفظ غير مخفف عند درجة حرارة 4 درجات مئوية. تم تنقية الجسم المضاد أحادي النسيلة من سائل مزرعة الأنسجة أو السائل الاستسقائي باستخدام كروماتوغرافيا التقارب. تم ربط الجسم المضاد بالبيوتين في ظل الظروف المثلى، وتمت إزالة البيوتين غير المتفاعل. تم ربط الجسم المضاد أو الستربتافيدين بالجسيمات المغناطيسية في ظل الظروف المثلى، وتمت إزالة الجسم المضاد/الستربتافيدين غير المرتبط.
إجراءات الفحص الموصى بها: فيما يلي بروتوكول الوسم المغناطيسي والإثراء المفصل. باختصار، يقوم مزيج إثراء الخلايا اللمفاوية التائية البشرية المُوسومة بالبيوتين بتلوين كريات الدم الحمراء والصفائح الدموية ومعظم كريات الدم البيضاء باستثناء الخلايا اللمفاوية التائية. بعد غسل الأجسام المضادة الزائدة، تُضاف جزيئات BD IMag™ Streptavidin Particles Plus - DM إلى معلق الخلايا، حيث ترتبط بالخلايا الحاملة للأجسام المضادة المُوسومة بالبيوتين. ثم يُوضع الأنبوب الذي يحتوي على معلق الخلايا الموسوم داخل المجال المغناطيسي لجهاز فصل الخلايا المغناطيسي BD IMag™ (رقم المنتج 552311). بعد ذلك، تُجرى عملية اختيار سلبي لإثراء الخلايا التائية غير الموسومة. تهاجر الخلايا الموسومة نحو المغناطيس (الجزء الموجب)، تاركةً الخلايا غير الموسومة في المعلق ليتم سحبها والاحتفاظ بها (الجزء المُثرى). تُكرر عملية الاختيار السلبي مرتين لزيادة كمية الجزء المُثرى. في حال الحاجة إلى نقاء أعلى، يمكن إجراء عملية اختيار سلبي على الجزء المُثرى. لتوضيح الإجراء، تم رسم خطوات الفصل المغناطيسي في مخطط انسيابي للإثراء. يمكن تقييم الأجزاء المُثرية (والإيجابية) في تطبيقات لاحقة مثل قياس التدفق الخلوي وزراعة الأنسجة. تم تحسين الأجسام المضادة في كوكتيل إثراء الخلايا اللمفاوية التائية البشرية المُؤشَّرة بالبيوتين وتخفيفها مسبقًا لتوفير أقصى كفاءة لإثراء الخلايا اللمفاوية التائية من الخلايا اللمفاوية أحادية النواة في الدم المحيطي. بروتوكول الوسم المغناطيسي والإثراء: 1. تحضير محلول BD IMag™ بتركيز 1X: خفف محلول BD IMag™ (10X) (رقم المنتج 552362) بنسبة 1:10 باستخدام ماء مقطر معقم أو حضّر محلول ملحي مُخفَّف بالفوسفات (PBS) مُدعَّم بـ 0.5% من ألبومين المصل البقري (BSA) و2 ملي مول من ثنائي أمين الإيثيلين رباعي حمض الأسيتيك (EDTA) و0.1% من أزيد الصوديوم. ٢. حضّر الخلايا الليمفاوية أحادية النواة من الدم البشري المعالج بمضادات التخثر، ويفضل استخدام تقنية الطرد المركزي بتدرج الكثافة باستخدام محلول فيكول-باك™.* ٣. أزل تجمعات الخلايا و/أو الحطام بتمرير المعلق عبر مصفاة خلايا من النايلون بمسام ٧٠ ميكرومتر. عدّ الخلايا، وأعد تعليقها في محلول BD IMag™ بتركيز ١٠ × ١٠^٦ خلية/مل. ٤. أضف مزيج إثراء الخلايا الليمفاوية التائية البشرية المبيوتينية بمقدار ٥ ميكرولتر لكل ١ × ١٠^٦ خلية، وحضّن المزيج في درجة حرارة الغرفة لمدة ١٥ دقيقة.† ٥. اغسل الخلايا الموسومة بحجم زائد ١٠ أضعاف من محلول BD IMag™، ثم افصلها بالطرد المركزي عند ٣٠٠ × g لمدة ٧ دقائق، واسحب كل السائل الطافي بعناية. ٦. رجّ محلول BD IMag™ Streptavidin Particles Plus - DM جيدًا، وأضف ٥ ميكرولتر من الجسيمات لكل ١ × ١٠^٦ خلية. ٧. اخلط جيدًا. حضّن في درجة حرارة الغرفة لمدة ٣٠ دقيقة.† ٨. ارفع حجم الوسم إلى تركيز ٢٠-٨٠ × ١٠^٦ خلية/مل باستخدام محلول BD IMag™ المخفف ١X. ٩. انقل الخلايا الموسومة إلى أنبوب اختبار ذي قاع مستدير ١٢ × ٧٥ مم، بحيث لا يتجاوز الحجم المضاف ١.٠ مل. ضع أنبوب الجزء الموجب هذا على مغناطيس فصل الخلايا (في الوضع الأفقي) لمدة ٦ إلى ٨ دقائق. - للحصول على حجم أكبر، انقل الخلايا إلى أنبوب اختبار ذي قاع مستدير ١٧ × ١٠٠ مم، بحيث لا يتجاوز الحجم المضاف ٣.٠ مل. ضع أنبوب الجزء الموجب هذا على مغناطيس فصل الخلايا (في الوضع الرأسي) لمدة ٨ دقائق. ١٠. مع وضع الأنبوب على مغناطيس فصل الخلايا، وباستخدام ماصة باستور زجاجية معقمة، اسحب السائل الطافي (الجزء المُخصب) بعناية وضعه في أنبوب معقم جديد. ١١. أخرج أنبوب الجزء الموجب من مغناطيس فصل الخلايا، وأضف محلول BD IMag™ بتركيز ١X إلى نفس الحجم كما في الخطوة ٨. أعد تعليق الجزء الموجب جيدًا عن طريق السحب والدفع بالماصة من ١٠ إلى ١٥ مرة، ثم أعد الأنبوب إلى مغناطيس فصل الخلايا لمدة ٦ إلى ٨ دقائق. - بالنسبة لأنبوب ١٧ × ١٠٠ مم: ضعه على مغناطيس فصل الخلايا لمدة ٨ دقائق. ١٢. باستخدام ماصة باستور معقمة جديدة، اسحب السائل الطافي بعناية واخلطه مع الجزء المُخصب من الخطوة ١٠ أعلاه. ١٣. كرر الخطوتين ١١ و١٢. يحتوي الجزء المُخصب المُدمج على خلايا ليمفاوية تائية بدون أجسام مضادة أو جزيئات مغناطيسية مرتبطة به. هذه الخلايا جاهزة للتطبيقات اللاحقة، أو يمكن زيادة تركيزها بالانتقال إلى الخطوة 15. 14. يمكن إعادة تعليق خلايا الجزء الموجب المتبقية في الأنبوب الأصلي في محلول منظم أو وسط زراعة مناسب للتطبيقات اللاحقة، بما في ذلك قياس التدفق الخلوي، إذا لزم الأمر. 15. لزيادة نقاء الجزء المُركّز بنسبة 2-4% إضافية (قارن بين اللوحتين الوسطى اليسرى واليمنى في الشكل)، ضع الأنبوب الذي يحتوي على الجزء المُركّز على مغناطيس فصل الخلايا لمدة 6 إلى 8 دقائق أخرى. - بالنسبة لأنبوب 17 × 100 مم: ضعه على مغناطيس فصل الخلايا لمدة 8 دقائق. 16. اسحب السائل الطافي بعناية وضعه في أنبوب معقم جديد. هذا هو الجزء المُركّز مرتين. الخلايا جاهزة للمعالجة للتطبيقات اللاحقة. 17. يجب تحليل عينات من معلق الخلايا الكلي والأجزاء الموجبة والمُركّزة بواسطة قياس التدفق الخلوي لتقييم كفاءة إجراء فصل الخلايا. ملاحظات: * نصائح لتحضير الخلايا بنجاح: - اسحب الدم في أنبوب يحتوي على EDTA. - افصل البلازما الغنية بالصفائح الدموية عن طريق الطرد المركزي مرة واحدة بسرعة 220-240 × g. - اغسل الخلايا 2-3 مرات بمحلول PBS بعد فصلها باستخدام تدرج الكثافة. - بعد الغسلة الأخيرة، أعد تعليق الخلايا بتركيز عالٍ نسبيًا في محلول BD IMag™ 1X، ثم انتقل إلى الخطوة 3. † تجنب التلوين غير المحدد بالعمل بسرعة والالتزام بأوقات الحضانة الموصى بها.
إشعارات المنتج: تحذير: ينتج أزيد الصوديوم حمض الهيدرازويك شديد السمية في الظروف الحمضية. خفف مركبات الأزيد بالماء الجاري قبل التخلص منها لتجنب تراكم رواسب قابلة للانفجار في أنابيب الصرف الصحي. مصدر جميع بروتينات المصل هو مسالخ معتمدة من وزارة الزراعة الأمريكية، وتقع في الولايات المتحدة. تُحضّر جزيئات BD IMag™ من جزيئات مغناطيسية مُعدّلة وظيفيًا بمجموعة الكربوكسيل، تُصنّعها شركة Skold Technology، وهي مرخصة بموجب براءة الاختراع الأمريكية رقم 7,169,618. Ficoll-Paque هي علامة تجارية لشركة Amersham Biosciences Limited. للاطلاع على أطياف الفلوركروم وإعدادات الجهاز المناسبة، يُرجى زيارة صفحة قياس التدفق الخلوي متعدد الألوان على موقعنا الإلكتروني www.bdbiosciences.com/colors. للاطلاع على البروتوكولات الفنية، يُرجى زيارة www.bdbiosciences.com/us/s/resources.
الوصف: معرف EntrezGene
غير متاح : غير متاح