BD، 557954، مجموعة إثراء خلايا NK للفئران BD IMag™-DM

الوضع التنظيمي: للاستخدام البحثي فقط
RRID: AB_2869110
الوصف: تُستخدم مجموعة BD IMag™ Mouse NK Cell Enrichment Set - DM للاختيار السلبي للخلايا القاتلة الطبيعية (NK) من طحال أو عقدة لمفاوية للفأر. يحتوي كوكتيل Biotinylated Mouse NK Cell Enrichment Set على أجسام مضادة وحيدة النسيلة تتعرف على المستضدات الموجودة على كريات الدم الحمراء والبيضاء الطرفية التي لا تُعد خلايا NK. أما جزيئات BD IMag™ Streptavidin Particles Plus - DM فهي جزيئات نانوية مغناطيسية مرتبطة تساهميًا بالستربتافيدين على أسطحها. بفضل هذين المكونين، تتجنب مجموعة BD IMag™ Mouse NK Cell Enrichment Set - DM التنشيط غير المقصود للخلايا NK المُثرية باستخدام كواشف لا ترتبط مباشرةً بتلك الخلايا. تم تحسين هذه المجموعة للاستخدام مع مغناطيس فصل الخلايا BD IMag™، وتحتوي على كمية كافية من الكواشف لوسم 10^9 من كريات الدم البيضاء. يتكون مزيج إثراء خلايا NK الفأرية المُبَيوْتَنة من الأجسام المضادة وحيدة النسيلة التالية المُقترنة بالبيوتين: مضاد CD4 الفأري (L3T4)، المستنسخ GK1.5؛ مضاد CD5 الفأري (Ly-1)، المستنسخ 53-7.3؛ مضاد CD8a الفأري (Ly-2)، المستنسخ 53-6.7؛ مضاد CD19 الفأري، المستنسخ 1D3؛ مضاد CD24 الفأري (مستضد ثابت حراريًا)، المستنسخ M1/69؛ مضاد Ly-6G وLy-6C الفأري (Gr-1)، المستنسخ RB6-8C5؛ مضاد TER-119/الخلايا الحمراء الفأرية، المستنسخ TER-119.
التحضير والتخزين: يُحفظ غير مخفف عند درجة حرارة 4 درجات مئوية. تم تنقية الجسم المضاد أحادي النسيلة من سائل مزرعة الأنسجة أو السائل الاستسقائي باستخدام كروماتوغرافيا التقارب. تم ربط الجسم المضاد بالبيوتين في ظل الظروف المثلى، وتمت إزالة البيوتين غير المتفاعل. تم ربط الجسم المضاد أو الستربتافيدين بالجسيمات المغناطيسية في ظل الظروف المثلى، وتمت إزالة الجسم المضاد/الستربتافيدين غير المرتبط.
إجراءات الفحص الموصى بها: فيما يلي بروتوكول الوسم المغناطيسي والإثراء المفصل. باختصار، يقوم مزيج إثراء خلايا NK الفأرية المُوسومة بالبيوتين بتلوين كريات الدم الحمراء ومعظم كريات الدم البيضاء باستثناء خلايا NK. بعد غسل الأجسام المضادة الزائدة، تُضاف جزيئات BD IMag Streptavidin Particles Plus - DM إلى معلق الخلايا، حيث ترتبط بالخلايا الحاملة للأجسام المضادة المُوسومة بالبيوتين. ثم يُوضع الأنبوب الذي يحتوي على معلق الخلايا الموسوم داخل المجال المغناطيسي لجهاز فصل الخلايا المغناطيسي BD IMag™ (رقم المنتج 552311). بعد ذلك، تُجرى عملية اختيار سلبي لإثراء خلايا NK غير الموسومة. تهاجر الخلايا الموسومة نحو المغناطيس (الجزء الموجب)، تاركةً الخلايا غير الموسومة في المعلق ليتم سحبها والاحتفاظ بها (الجزء المُثرى). تُكرر عملية الاختيار السلبي مرتين لزيادة كمية الجزء المُثرى. وللحصول على نقاء أعلى، يُجرى الاختيار السلبي على الجزء المُثرى. لتوضيح الإجراء، تم رسم خطوات الفصل المغناطيسي في مخطط انسيابي للإثراء. يمكن تقييم الأجزاء المُثرية والإيجابية في تطبيقات لاحقة مثل قياس التدفق الخلوي وزراعة الأنسجة. تم تحسين الأجسام المضادة في كوكتيل إثراء خلايا NK الفأرية المُؤشَّرة بالبيوتين وتخفيفها مسبقًا لتوفير أقصى كفاءة لإثراء خلايا NK من الأعضاء اللمفاوية المحيطية. بروتوكول الوسم المغناطيسي والإثراء: 1. تحضير معلق خلوي أحادي من النسيج اللمفاوي المحيطي المطلوب بطريقة معقمة. إزالة تكتلات الخلايا و/أو الحطام عن طريق تمرير الخلايا المعلقة عبر مصفاة خلايا من النايلون بمسام 70 ميكرومتر. يجب تحضير معلقات الخلايا في وسط زراعة الأنسجة.* 2. عد الخلايا. إذا كان التركيز بين 10 × 10^6 و 20 × 10^6 خلية/مل، فانتقل إلى الخطوة 3. إذا كانت الخلايا أكثر تخفيفًا من 10 × 10^6 خلية/مل، فقم بفصل الخلايا وإعادة تعليقها في وسط زراعة الأنسجة بتركيز 20 × 10^6 خلية/مل. 3. اختياري: أضف BD Mouse Fc Block™، وهو جسم مضاد أحادي النسيلة 2.4G2 مُنقّى ضد CD16/CD32 للفأر (رقم المنتج 553141/553142)، بمقدار 0.25 ميكروغرام لكل 1 × 10^6 خلية، وحضّن على الجليد لمدة 15 دقيقة.† 4. أضف مزيج إثراء خلايا NK الفأرية المُعدّلة بيولوجيًا بمقدار 5 ميكرولتر لكل 1 × 10^6 خلية، وحضّن على الجليد لمدة 15 دقيقة.‡ 5. اغسل الخلايا المُوسومة بحجم زائد 10 أضعاف من وسط زراعة الأنسجة*، ثمّ قم بالطرد المركزي عند 300 × g لمدة 7 دقائق، واسحب كل السائل الطافي بعناية. 6. رجّ جزيئات BD™ IMag Streptavidin Particles Plus - DM جيدًا، وأضف 5 ميكرولتر من الجزيئات لكل 1 × 10^6 خلية. ٧. اخلط جيدًا. ضعه في الثلاجة لمدة ٣٠ دقيقة عند درجة حرارة تتراوح بين ٦ و١٢ درجة مئوية.‡ ٨. ارفع حجم الخلايا الموسومة إلى تركيز يتراوح بين ٢٠ و٨٠ × ١٠^٦ خلية/مل باستخدام وسط زراعة الأنسجة.* ٩. انقل الخلايا الموسومة إلى أنبوب اختبار ذي قاع مستدير مقاس ١٢ × ٧٥ مم، بحيث لا يتجاوز الحجم المضاف ١.٠ مل. ضع أنبوب الجزء الموجب هذا على مغناطيس فصل الخلايا (في الوضع الأفقي) لمدة تتراوح بين ٦ و٨ دقائق. - للحصول على حجم أكبر، انقل الخلايا إلى أنبوب اختبار ذي قاع مستدير مقاس ١٧ × ١٠٠ مم، بحيث لا يتجاوز الحجم المضاف ٣.٠ مل. ضع أنبوب الجزء الموجب هذا على مغناطيس فصل الخلايا (في الوضع الرأسي) لمدة ٨ دقائق. ١٠. مع وضع الأنبوب على مغناطيس فصل الخلايا، وباستخدام ماصة باستور زجاجية معقمة، اسحب السائل الطافي (الجزء المُخصب) بعناية وضعه في أنبوب معقم جديد. ١١. أخرج أنبوب الجزء الموجب من مغناطيس فصل الخلايا، وأضف وسط زراعة الأنسجة* بنفس الحجم كما في الخطوة ٨. أعد تعليق الجزء الموجب جيدًا عن طريق السحب والدفع بالماصة من ١٠ إلى ١٥ مرة، ثم أعد الأنبوب إلى مغناطيس فصل الخلايا لمدة ٦ إلى ٨ دقائق. - بالنسبة لأنبوب ١٧ × ١٠٠ مم: ضعه على مغناطيس فصل الخلايا لمدة ٨ دقائق. ١٢. باستخدام ماصة باستور معقمة جديدة، اسحب السائل الطافي بعناية واخلطه مع الجزء المُخصب من الخطوة ١٠ أعلاه. ١٣. اختياري: لزيادة نسبة الاستخلاص في الجزء المُخصب المُدمج بنسبة ٥-١٠٪ إضافية دون التأثير على نقاء خلايا NK، كرر الخطوتين ١١ و١٢ مرة واحدة. ١٤. ضع الأنبوب الذي يحتوي على الجزء المُخصب المُدمج على مغناطيس فصل الخلايا لمدة ٦ إلى ٨ دقائق إضافية. - بالنسبة لأنبوب ١٧ × ١٠٠ مم: ضعه على مغناطيس فصل الخلايا لمدة ٨ دقائق. ١٥. اسحب السائل الطافي بعناية وضعه في أنبوب معقم جديد. يحتوي هذا الجزء المُخصب مرتين على خلايا NK بدون أجسام مضادة أو جزيئات مغناطيسية مرتبطة به.† الخلايا جاهزة للمعالجة في التطبيقات اللاحقة. ١٦. يمكن إعادة تعليق خلايا الجزء الموجب المتبقية في الأنبوب الأصلي في محلول منظم أو وسط زراعة مناسب للتطبيقات اللاحقة، بما في ذلك قياس التدفق الخلوي، إذا رغبت في ذلك. ١٧. يجب تحليل عينات من معلق الخلايا غير المفصول والأجزاء الموجبة والمُخصبة بواسطة قياس التدفق الخلوي لتقييم كفاءة إجراء فصل الخلايا. ملاحظات: * تحتوي بعض أوساط زراعة الأنسجة على البيوتين، الذي قد يتداخل مع ارتباط جزيئات الستربتافيدين. نوصي باستخدام وسط دولبيكو الأساسي الأدنى (DMEM). † استخدام الجسم المضاد أحادي النسيلة 2.4G2 المُنقّى والمُضاد لـ CD16/CD32 في الفئران، والمُستخلص من BD Mouse Fc Block™، في الخطوة 3، يزيد من الإنتاجية بنسبة 20% تقريبًا دون التأثير على نقاء الخلايا القاتلة الطبيعية. مع ذلك، يُرجى ملاحظة أن هذا يؤدي إلى زيادة تركيز الخلايا القاتلة الطبيعية المُخصبة، والتي يرتبط سطحها بالجسم المضاد أحادي النسيلة المُنقّى والمُضاد لـ CD16/CD32 في الفئران، مما قد يؤثر على وظيفة هذه الخلايا. ‡ تجنب الوسم غير النوعي بالعمل بسرعة والالتزام بأوقات الحضانة الموصى بها.
إشعارات المنتج: مصدر جميع بروتينات المصل هو مسالخ معتمدة من وزارة الزراعة الأمريكية، وتقع في الولايات المتحدة. تحذير: ينتج أزيد الصوديوم حمض الهيدرازويك شديد السمية في الظروف الحمضية. خفف مركبات الأزيد بالماء الجاري قبل التخلص منها لتجنب تراكم رواسب قابلة للانفجار في أنابيب الصرف الصحي. تُحضّر جزيئات BD IMag™ من جزيئات مغناطيسية مُعدّلة وظيفيًا بمجموعة الكربوكسيل، وهي من إنتاج شركة Skold Technology، ومرخصة بموجب براءة الاختراع الأمريكية رقم 7,169,618. يُرجى مراجعة www.bdbiosciences.com/us/s/resources للاطلاع على البروتوكولات الفنية.
الوصف: معرف EntrezGene
غير متاح : غير متاح