BD، 557955، مجموعة إثراء الخلايا المتغصنة للفئران BD IMag™ - DM

التطبيق: فصل الخلايا (يتم اختباره بشكل روتيني)
الوضع التنظيمي: للاستخدام البحثي فقط
RRID: AB_2869111
الوصف: تُستخدم مجموعة BD IMag™ لإثراء الخلايا المتغصنة للفئران - DM للاختيار السلبي للخلايا المتغصنة (DC) من طحال أو عقدة لمفاوية للفأر. يحتوي كوكتيل إثراء الخلايا المتغصنة للفئران المُؤشَّر بالبيوتين على أجسام مضادة وحيدة النسيلة تتعرف على المستضدات الموجودة على كريات الدم الحمراء والبيضاء الطرفية غير المتغصنة. أما جزيئات BD IMag Streptavidin Particles Plus - DM فهي جزيئات نانوية مغناطيسية مرتبطة تساهميًا بالستربتافيدين على أسطحها. بفضل هذين المكونين، تتجنب مجموعة BD IMag لإثراء الخلايا المتغصنة للفئران - DM التنشيط غير المقصود للخلايا المتغصنة المُثرية، وذلك باستخدام كواشف لا ترتبط مباشرةً بتلك الخلايا. تم تحسين هذه المجموعة للاستخدام مع مغناطيس فصل الخلايا BD IMag™، وتحتوي على كمية كافية من الكواشف لتوسيم 10^9 من كريات الدم البيضاء. يتكون مكون كوكتيل إثراء الخلايا المتغصنة من الأجسام المضادة وحيدة النسيلة التالية المرتبطة بالبيوتين: مضاد CD2 للفأر (LFA-2)، المستنسخ RM2-5؛ مضاد CD3e للفأر (سلسلة CD3 ε)، المستنسخ 145-2C11؛ مضاد CD45R/B220 للفأر، المستنسخ RA3-6B2؛ مضاد CD49b للفأر (سلسلة إنتغرين α2)، المستنسخ HMα2؛ مضاد CD147 للفأر (باسيجين)، المستنسخ RL73؛ مضاد Ly-6g وLy-6C للفأر (Gr-1)، المستنسخ RB6-8C5؛ مضاد TER-119/خلايا الدم الحمراء للفأر، المستنسخ TER-119.
التحضير والتخزين: يُحفظ غير مخفف عند درجة حرارة 4 درجات مئوية. تم تنقية الجسم المضاد أحادي النسيلة من سائل مزرعة الأنسجة أو السائل الاستسقائي باستخدام كروماتوغرافيا التقارب. تم ربط الجسم المضاد بالبيوتين في ظل الظروف المثلى، وتمت إزالة البيوتين غير المتفاعل. تم ربط الجسم المضاد أو الستربتافيدين بالجسيمات المغناطيسية في ظل الظروف المثلى، وتمت إزالة الجسم المضاد/الستربتافيدين غير المرتبط.
إجراءات الفحص الموصى بها: فيما يلي بروتوكول الوسم المغناطيسي والإثراء المفصل. باختصار، يقوم مزيج إثراء الخلايا المتغصنة الفأرية المُوسومة بالبيوتين بتلوين كريات الدم الحمراء ومعظم كريات الدم البيضاء باستثناء الخلايا المتغصنة. بعد غسل الأجسام المضادة الزائدة، تُضاف جزيئات BD IMag™ Streptavidin Particles Plus - DM إلى معلق الخلايا، حيث ترتبط بالخلايا الحاملة للأجسام المضادة المُوسومة بالبيوتين. ثم يُوضع الأنبوب الذي يحتوي على معلق الخلايا الموسوم داخل المجال المغناطيسي لجهاز فصل الخلايا المغناطيسي (رقم المنتج 552311). بعد ذلك، تُجرى عملية اختيار سلبي لإثراء الخلايا المتغصنة غير الموسومة. تهاجر الخلايا الموسومة نحو المغناطيس (الجزء الموجب)، تاركةً الخلايا غير الموسومة في المعلق ليتم سحبها والاحتفاظ بها (الجزء المُثرى). تُكرر عملية الاختيار السلبي مرة واحدة لزيادة كمية الجزء المُثرى. وللحصول على نقاء أعلى، يُجرى الاختيار السلبي على الجزء المُثرى. لتوضيح الإجراء، تم رسم خطوات الفصل المغناطيسي في مخطط انسيابي للإثراء. يمكن تقييم الأجزاء المُثرية والإيجابية في تطبيقات لاحقة مثل قياس التدفق الخلوي وزراعة الأنسجة. تم تحسين الأجسام المضادة في مزيج إثراء الخلايا المتغصنة الفأرية المُؤشَّرة بالبيوتين وتخفيفها مسبقًا لتوفير أقصى كفاءة لإثراء الخلايا المتغصنة من الأعضاء اللمفاوية الطرفية. بروتوكول الوسم والإثراء المغناطيسي: 1. تحضير محاليل معقمة ووضعها على الثلج. - محلول تلوين الخلايا: محلول ملحي مُخفَّف بالفوسفات مُدعَّم بـ 3% من مصل العجل الجنيني المُعطَّل حراريًا و0.1% من أزيد الصوديوم. - محلول BD IMag بتركيز 1X: يُخفَّف محلول BD IMag (10X) (رقم المنتج 552362) بنسبة 1:10 باستخدام ماء مقطر معقم، أو يُحضَّر محلول ملحي مُخفَّف بالفوسفات مُدعَّم بـ 0.5% من ألبومين المصل البقري (BSA)، و2 ملي مول من EDTA، و0.1% من أزيد الصوديوم. 2. يُحضَّر معلق خلوي أحادي من النسيج اللمفاوي المحيطي المطلوب، مع مراعاة التعقيم. تُزال تكتلات الخلايا و/أو الحطام بتمرير الخلايا المعلقة عبر مصفاة خلايا من النايلون بمسام 70 ميكرومتر. يجب تحضير معلقات الخلايا في محلول تلوين الخلايا. 3. تُحصى الخلايا. إذا كان تركيز الخلايا يتراوح بين 10 × 10^6 و20 × 10^6 خلية/مل، فانتقل إلى الخطوة 4. أما إذا كان تركيز الخلايا أقل من 10 × 10^6 خلية/مل، فقم بفصل الخلايا بالطرد المركزي وأعد تعليقها في محلول تلوين الخلايا بتركيز 20 × 10^6 خلية/مل. 4. اختياري: أضف BD Mouse Fc Block Purified Anti-Mouse CD16/CD32 mAb 2.4G2 (رقم المنتج 553141/553142) بمقدار 0.25 ميكروغرام لكل 1 × 10^6 خلية، ثم حضّنها على الجليد لمدة 15 دقيقة. ٥. أضف ٥ ميكرولتر من مزيج إثراء الخلايا المتغصنة الفأرية المُعَلَّمة بيولوجيًا لكل ١ × ١٠^٦ خلية، وحضّنها على الجليد لمدة ١٥ دقيقة.† ٦. اغسل الخلايا المُعَلَّمة بعشرة أضعاف حجم محلول BD IMag المُعَلَّم بتركيز ١X، ثمّ قم بالطرد المركزي عند ٣٠٠ × جم لمدة ٧ دقائق، واسحب كل السائل الطافي بعناية. ٧. رجّ جزيئات BD IMag Streptavidin Particles Plus - DM جيدًا، وأضف ٥ ميكرولتر من الجزيئات لكل ١ × ١٠^٦ خلية. ٨. اخلط جيدًا. ضعها في الثلاجة لمدة ٣٠ دقيقة عند درجة حرارة ٦-١٢ درجة مئوية.† ٩. ارفع حجم الوسم إلى تركيز ٢٠-٨٠ × ١٠^٦ خلية/مل باستخدام محلول BD IMag المُعَلَّم بتركيز ١X. ١٠. انقل الخلايا الموسومة إلى أنبوب اختبار ذي قاع مستدير بأبعاد ١٢ × ٧٥ مم، بحيث لا يتجاوز الحجم المضاف ١.٠ مل. ضع أنبوب الجزء الموجب هذا على مغناطيس فصل الخلايا (في الوضع الأفقي) لمدة ٦ إلى ٨ دقائق. - للحصول على حجم أكبر، انقل الخلايا إلى أنبوب اختبار ذي قاع مستدير بأبعاد ١٧ × ١٠٠ مم، بحيث لا يتجاوز الحجم المضاف ٣.٠ مل. ضع أنبوب الجزء الموجب هذا على مغناطيس فصل الخلايا (في الوضع الرأسي) لمدة ٨ دقائق. ١١. مع بقاء الأنبوب على مغناطيس فصل الخلايا، وباستخدام ماصة باستور زجاجية معقمة، اسحب السائل الطافي (الجزء المُخصب) بعناية وضعه في أنبوب معقم جديد. ١٢. أخرج أنبوب الجزء الموجب من جهاز فصل الخلايا المغناطيسي، وأضف محلول BD IMag بتركيز ١X إلى نفس الحجم كما في الخطوة ٨. أعد تعليق الجزء الموجب جيدًا عن طريق سحب المحلول ودفعه بالماصة من ١٠ إلى ١٥ مرة، ثم ضع الأنبوب مرة أخرى على جهاز فصل الخلايا المغناطيسي لمدة ٦ إلى ٨ دقائق. - بالنسبة لأنبوب ١٧ × ١٠٠ مم: ضعه على جهاز فصل الخلايا المغناطيسي لمدة ٨ دقائق. ١٣. باستخدام ماصة باستور معقمة جديدة، اسحب السائل الطافي بحرص واخلطه مع الجزء المُخصب من الخطوة ١٠ أعلاه. ١٤. ضع الأنبوب الذي يحتوي على الجزء المُخصب المُدمج على جهاز فصل الخلايا المغناطيسي لمدة ٦ إلى ٨ دقائق أخرى. - بالنسبة لأنبوب ١٧ × ١٠٠ مم: ضعه على جهاز فصل الخلايا المغناطيسي لمدة ٨ دقائق. ١٥. اسحب السائل الطافي بحرص وضعه في أنبوب معقم جديد. يحتوي هذا الجزء المُخصب مرتين على خلايا متغصنة خالية من الأجسام المضادة أو الجسيمات المغناطيسية المرتبطة بها. الخلايا جاهزة للمعالجة في التطبيقات اللاحقة. ١٦. يمكن إعادة تعليق خلايا الجزء الموجب المتبقية في الأنبوب الأصلي في محلول منظم أو وسط زراعة مناسب للتطبيقات اللاحقة، بما في ذلك قياس التدفق الخلوي، إذا لزم الأمر. ١٧. يجب تحليل عينات من معلق الخلايا غير المفصول والأجزاء الموجبة والمُثرية باستخدام قياس التدفق الخلوي لتقييم كفاءة عملية فصل الخلايا. ملاحظات: - استخدام BD Mouse Fc Block™ Purified Anti-Mouse CD16/CD32 mAb 2.4G2 في الخطوة ٤ يزيد من المردود بنسبة ١٥-٢٥٪ مع تقليل نقاء الخلايا المتغصنة بنسبة ٧-١٥٪. يُرجى ملاحظة أن هذا ينتج عنه خلايا متغصنة مُثرية قد تحتوي على أجسام مضادة وحيدة النسيلة مُنقاة مضادة للفأر CD16/CD32 مرتبطة بسطحها، مما قد يؤثر على وظيفة هذه الخلايا المتغصنة. † تجنب الوسم غير المحدد بالعمل بسرعة والالتزام بأوقات الحضانة الموصى بها.
إشعارات المنتج: مصدر جميع بروتينات المصل هو مسالخ معتمدة من وزارة الزراعة الأمريكية، وتقع في الولايات المتحدة. تحذير: ينتج أزيد الصوديوم حمض الهيدرازويك شديد السمية في الظروف الحمضية. خفف مركبات الأزيد بالماء الجاري قبل التخلص منها لتجنب تراكم رواسب قابلة للانفجار في أنابيب الصرف الصحي. تُحضّر جزيئات BD IMag™ من جزيئات مغناطيسية مُعدّلة وظيفيًا بمجموعة الكربوكسيل، وهي من إنتاج شركة Skold Technology، ومرخصة بموجب براءة الاختراع الأمريكية رقم 7,169,618. يُرجى مراجعة www.bdbiosciences.com/us/s/resources للاطلاع على البروتوكولات الفنية.
الوصف: معرف EntrezGene
غير متاح : غير متاح