BD، 557987، مجموعة إثراء الخلايا القاتلة الطبيعية البشرية BD IMag™ - DM

التطبيق: فصل الخلايا (يتم اختباره بشكل روتيني)
الوضع التنظيمي: للاستخدام البحثي فقط
RRID: AB_2869115
الوصف: تُستخدم مجموعة BD IMag™ Human NK Cell Enrichment Set - DM للاختيار السلبي للخلايا القاتلة الطبيعية (NK) من الدم المحيطي. يحتوي كوكتيل Biotinylated Human NK Cell Enrichment Cocktail على أجسام مضادة وحيدة النسيلة تتعرف على المستضدات الموجودة على كريات الدم الحمراء والصفائح الدموية وكريات الدم البيضاء المحيطية (بما في ذلك خلايا NK-T) التي لا تُعد خلايا NK. أما جزيئات BD IMag™ Streptavidin Particles Plus - DM فهي جزيئات نانوية مغناطيسية مرتبطة تساهميًا بالستربتافيدين على أسطحها. بفضل هذين المكونين، تتجنب مجموعة BD IMag™ Human NK Cell Enrichment Set - DM التنشيط غير المقصود للخلايا القاتلة الطبيعية المُثرية، وذلك باستخدام كواشف لا ترتبط مباشرةً بتلك الخلايا. تم تحسين هذه المجموعة للاستخدام مع مغناطيس فصل الخلايا BD IMag™، وتحتوي على كمية كافية من الكواشف لوسم 10^9 خلية أحادية النواة في الدم المحيطي (PBMC). يتكون مكون كوكتيل إثراء الخلايا القاتلة الطبيعية من الأجسام المضادة وحيدة النسيلة التالية المرتبطة بالبيوتين: مضاد CD3 البشري، المستنسخ UCHT1؛ مضاد CD19 البشري، المستنسخ HIB19؛ مضاد CD36 البشري، المستنسخ CB38 (NL07)؛ مضاد CD41a البشري، المستنسخ HIP8؛ مضاد CD66b البشري، المستنسخ G10F5؛ مضاد CD123 البشري (سلسلة ألفا لمستقبل IL-3)، المستنسخ 9F5؛ مضاد CD235a البشري (جليكوبروتين A)، المستنسخ GA-R2 (HIR2)؛ مضاد IgE البشري، المستنسخ G7-26
التحضير والتخزين: يُحفظ غير مخفف عند درجة حرارة 4 درجات مئوية. تم تنقية الجسم المضاد أحادي النسيلة من سائل مزرعة الأنسجة أو السائل الاستسقائي باستخدام كروماتوغرافيا التقارب. تم ربط الجسم المضاد بالبيوتين في ظل الظروف المثلى، وتمت إزالة البيوتين غير المتفاعل. تم ربط الجسم المضاد أو الستربتافيدين بالجسيمات المغناطيسية في ظل الظروف المثلى، وتمت إزالة الجسم المضاد/الستربتافيدين غير المرتبط.
إجراءات الفحص الموصى بها: فيما يلي بروتوكول الوسم المغناطيسي والإثراء المفصل. باختصار، يقوم مزيج إثراء خلايا NK البشرية المُوسومة بالبيوتين بتلوين كريات الدم الحمراء والصفائح الدموية ومعظم كريات الدم البيضاء باستثناء خلايا NK. بعد غسل الأجسام المضادة الزائدة، تُضاف جزيئات BD IMag™ Streptavidin Particles Plus - DM إلى معلق الخلايا، حيث ترتبط بالخلايا الحاملة للأجسام المضادة المُوسومة بالبيوتين. ثم يُوضع الأنبوب الذي يحتوي على معلق الخلايا الموسوم داخل المجال المغناطيسي لجهاز فصل الخلايا المغناطيسي BD IMag™ (رقم المنتج 552311). بعد ذلك، تُجرى عملية اختيار سلبي لإثراء خلايا NK غير الموسومة. تهاجر الخلايا الموسومة نحو المغناطيس (الجزء الموجب)، تاركةً الخلايا غير الموسومة في المعلق ليتم سحبها والاحتفاظ بها (الجزء المُثرى). تُكرر عملية الاختيار السلبي مرتين لزيادة كمية الجزء المُثرى. في حال الحاجة إلى نقاء أعلى، يمكن إجراء عملية اختيار سلبي على الجزء المُثرى. لتوضيح الإجراء، تم رسم خطوات الفصل المغناطيسي في مخطط انسيابي للإثراء. يمكن تقييم الأجزاء الموجبة والمُثرية في تطبيقات لاحقة مثل قياس التدفق الخلوي وزراعة الأنسجة. تم تحسين الأجسام المضادة في كوكتيل إثراء خلايا NK البشرية المُؤشَّرة بالبيوتين وتخفيفها مسبقًا لتوفير أقصى كفاءة لإثراء خلايا NK من الخلايا الليمفاوية أحادية النواة في الدم المحيطي (PBMC). بروتوكول الوسم المغناطيسي والإثراء: 1. تحضير محلول BD IMag™ بتركيز 1X: خفف محلول BD IMag™ (10X) (رقم المنتج 552362) بنسبة 1:10 باستخدام ماء مقطر معقم أو حضّر محلول ملحي مُخفَّف بالفوسفات (PBS) مُدعَّم بـ 0.5% من ألبومين المصل البقري (BSA) و2 ملي مول من EDTA و0.1% من أزيد الصوديوم. 1. حضّر الخلايا الليمفاوية أحادية النواة من الدم البشري المعالج بمضادات التخثر، ويفضل استخدام تقنية الطرد المركزي بتدرج الكثافة باستخدام محلول فيكول-باك™. 2. أزل تجمعات الخلايا و/أو الحطام بتمرير المعلق عبر مصفاة خلايا نايلون بمسام 70 ميكرومتر. عدّ الخلايا، وأعد تعليقها في محلول BD IMag™ بتركيز 1X، أي ما يعادل 10 × 10^6 خلية/مل. 3. أضف 5 ميكرولتر من مزيج إثراء الخلايا القاتلة الطبيعية البشرية المبيوتينية لكل 1 × 10^6 خلية، وحضّن المزيج في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.† 4. اغسل الخلايا الموسومة بحجم زائد 10 أضعاف من محلول BD IMag™ بتركيز 1X، ثم قم بالطرد المركزي عند 300 × g لمدة 7 دقائق، واسحب السائل الطافي بالكامل بعناية. ٥. رجّ محلول BD IMag™ Streptavidin Particles Plus - DM جيدًا، وأضف ٥ ميكرولتر من الجسيمات لكل ١ × ١٠^٦ خلية. ٦. اخلط جيدًا. حضّن في درجة حرارة الغرفة لمدة ٣٠ دقيقة.† ٧. ارفع حجم الوسم إلى تركيز ٢٠-٨٠ × ١٠^٦ خلية/مل باستخدام محلول BD IMag buffer بتركيز ١X. ٨. انقل الخلايا الموسومة إلى أنبوب اختبار ذي قاع مستدير ١٢ × ٧٥ مم، بحيث لا يتجاوز الحجم المضاف ١.٠ مل. ضع أنبوب الجزء الموجب هذا على مغناطيس فصل الخلايا (في الوضع الأفقي) لمدة ٦ إلى ٨ دقائق. - للحصول على حجم أكبر، انقل الخلايا إلى أنبوب اختبار ذي قاع مستدير ١٧ × ١٠٠ مم، بحيث لا يتجاوز الحجم المضاف ٣.٠ مل. ضع أنبوب الجزء الموجب هذا على مغناطيس فصل الخلايا (في الوضع الرأسي) لمدة ٨ دقائق. ٩. مع وضع الأنبوب على مغناطيس فصل الخلايا، وباستخدام ماصة باستور زجاجية معقمة، اسحب السائل الطافي (الجزء المُخصب) بعناية وضعه في أنبوب معقم جديد. ١٠. أخرج أنبوب الجزء الموجب من مغناطيس فصل الخلايا، وأضف محلول BD IMag™ بتركيز ١X إلى نفس الحجم كما في الخطوة ٨. أعد تعليق الجزء الموجب جيدًا عن طريق السحب والدفع بالماصة من ١٠ إلى ١٥ مرة، ثم أعد الأنبوب إلى مغناطيس فصل الخلايا لمدة ٦ إلى ٨ دقائق. - بالنسبة لأنبوب ١٧ × ١٠٠ مم: ضعه على مغناطيس فصل الخلايا لمدة ٨ دقائق. ١١. باستخدام ماصة باستور معقمة جديدة، اسحب السائل الطافي بعناية واخلطه مع الجزء المُخصب من الخطوة ١٠ أعلاه. ١٢. كرر الخطوتين ١١ و١٢. يحتوي الجزء المُخصب المُدمج على خلايا NK بدون أجسام مضادة أو جزيئات مغناطيسية مرتبطة بها. ١٣. لزيادة نقاء الجزء المُخصب المُدمج بنسبة ٥٪ أو أكثر (قارن بين اللوحتين الوسطى اليسرى واليمنى في الشكل)، ضع الأنبوب الذي يحتوي على الجزء المُخصب المُدمج على مغناطيس فصل الخلايا لمدة ٦ إلى ٨ دقائق إضافية. - بالنسبة لأنبوب ١٧ × ١٠٠ مم: ضعه على مغناطيس فصل الخلايا لمدة ٨ دقائق. ١٤. اسحب السائل الطافي بعناية وضعه في أنبوب معقم جديد. هذا هو الجزء المُخصب مرتين. الخلايا جاهزة للمعالجة في التطبيقات اللاحقة. ١٥. يمكن إعادة تعليق خلايا الجزء الموجب المتبقية في الأنبوب الأصلي في محلول منظم مناسب أو وسط زراعة للتطبيقات اللاحقة، بما في ذلك قياس التدفق الخلوي، إذا لزم الأمر. ١٦. يجب تحليل عينات من معلق الخلايا الكلي والأجزاء الموجبة والمُخصبة بواسطة قياس التدفق الخلوي لتقييم كفاءة إجراء فصل الخلايا. * نصائح لتحضير الخلايا بنجاح: - اسحب الدم في أنبوب يحتوي على EDTA. - افصل البلازما الغنية بالصفائح الدموية عن طريق الطرد المركزي مرة واحدة بسرعة 220-240 × g. - اغسل الخلايا 2-3 مرات بمحلول PBS بعد فصلها باستخدام تدرج الكثافة. - بعد الغسلة الأخيرة، أعد تعليق الخلايا بتركيز عالٍ نسبيًا في محلول BD IMag™ 1X، ثم انتقل إلى الخطوة 3. † تجنب التلوين غير المحدد بالعمل بسرعة والالتزام بأوقات الحضانة الموصى بها.
إشعارات المنتج: يُرجى مراجعة www.bdbiosciences.com/us/s/resources للاطلاع على البروتوكولات الفنية. تُحضّر جزيئات BD IMag™ من جزيئات مغناطيسية مُعدّلة بمجموعات الكربوكسيل، تُصنّعها شركة Skold Technology بموجب ترخيص براءة الاختراع الأمريكية رقم 7,169,618. Ficoll-Paque هي علامة تجارية مسجلة لشركة Amersham Biosciences Limited. تحذير: يُنتج أزيد الصوديوم حمض الهيدرازويك شديد السمية في الظروف الحمضية. يجب تخفيف مركبات الأزيد بالماء الجاري قبل التخلص منها لتجنب تراكم رواسب قابلة للانفجار في أنابيب الصرف الصحي. مصدر جميع بروتينات المصل هو مسالخ معتمدة من وزارة الزراعة الأمريكية، وتقع في الولايات المتحدة.
الوصف: معرف EntrezGene
غير متاح : غير متاح