BD، 558007، مجموعة BD IMag™ لإثراء الخلايا الليمفاوية البائية البشرية - DM

التطبيق: فصل الخلايا (يتم اختباره بشكل روتيني)
الوضع التنظيمي: للاستخدام البحثي فقط
RRID: AB_2869116
الوصف: تُستخدم مجموعة BD IMag™ لإثراء الخلايا اللمفاوية البائية البشرية - DM للاختيار السلبي للخلايا اللمفاوية البائية من الدم المحيطي. يحتوي كوكتيل إثراء الخلايا اللمفاوية البائية البشرية المُؤشَّر بالبيوتين على أجسام مضادة وحيدة النسيلة تتعرف على المستضدات الموجودة على كريات الدم الحمراء والصفائح الدموية وكريات الدم البيضاء المحيطية، ولكن ليس على الخلايا اللمفاوية البائية. أما جزيئات BD IMag™ Streptavidin Particles Plus - DM فهي جزيئات مغناطيسية مرتبطة تساهميًا بالستربتافيدين على أسطحها. بفضل هذين المكونين، تتجنب مجموعة BD IMag™ لإثراء الخلايا اللمفاوية البائية البشرية - DM التنشيط غير المقصود للخلايا اللمفاوية البائية المُثرية، وذلك باستخدام كواشف لا ترتبط مباشرةً بالخلايا اللمفاوية البائية. تم تحسين هذه المجموعة للاستخدام مع مغناطيس فصل الخلايا BD IMag™، وتحتوي على كمية كافية من الكواشف لتوسيم 10^9 خلية أحادية النواة في الدم المحيطي (PBMC). يتكون مزيج إثراء الخلايا اللمفاوية البائية البشرية المُؤشَّر بالبيوتين من الأجسام المضادة التالية: مضاد CD3 البشري، المستنسخ UCHT1؛ مضاد CD41a البشري، المستنسخ HIP8؛ مضاد CD43 البشري، المستنسخ L60؛ مضاد CD235a البشري، المستنسخ GA-R2
التحضير والتخزين: يُحفظ غير مخفف عند درجة حرارة 4 درجات مئوية. تم تنقية الجسم المضاد أحادي النسيلة من سائل مزرعة الأنسجة أو السائل الاستسقائي باستخدام كروماتوغرافيا التقارب. تم ربط الجسم المضاد بالبيوتين في ظل الظروف المثلى، وتمت إزالة البيوتين غير المتفاعل. تم ربط الجسم المضاد أو الستربتافيدين بالجسيمات المغناطيسية في ظل الظروف المثلى، وتمت إزالة الجسم المضاد/الستربتافيدين غير المرتبط.
إجراءات التحليل الموصى بها: باختصار، عند إضافة مزيج إثراء الخلايا الليمفاوية البائية البشرية المُؤشَّر بالبيوتين إلى العينة، فإنه يُلوِّن في الوقت نفسه كريات الدم الحمراء والصفائح الدموية ومعظم كريات الدم البيضاء، باستثناء الخلايا الليمفاوية البائية. بعد غسل أي أجسام مضادة زائدة لم ترتبط بالخلايا أثناء التلوين، تُضاف جزيئات BD IMag™ Streptavidin Particles Plus - DM إلى معلق الخلايا، حيث ترتبط بالأجسام المضادة المُؤشَّرة بالبيوتين. ثم يُوضع الأنبوب الذي يحتوي على معلق الخلايا المُوسَّم داخل المجال المغناطيسي لجهاز فصل الخلايا المغناطيسي BD IMag™. بعد ذلك، تُجرى عملية اختيار سلبي لإثراء الخلايا الليمفاوية البائية غير المُوسَّمة. ستهاجر الخلايا المُوسَّمة بالستربتافيدين نحو المغناطيس (وتُسمى الجزء الموجب)، تاركةً الخلايا غير المُوسَّمة في المعلق ليتم سحبها والاحتفاظ بها (وتُسمى الجزء المُثرى). تُكرَّر عملية الاختيار السلبي مرتين لزيادة كمية الجزء المُثرى. في حال الحاجة إلى نقاء أعلى، يمكن إجراء جولات إضافية من الانتقاء السلبي على الجزء المُخصب. يوضح مخطط انسيابي التخصيب تمثيلًا بيانيًا لإجراء الفصل المغناطيسي الموصوف. تم تحسين الأجسام المضادة في مزيج تخصيب الخلايا الليمفاوية البائية البشرية المُؤشَّرة بالبيوتين وتخفيفها مسبقًا لتوفير أقصى كفاءة لتخصيب الخلايا الليمفاوية البائية من الخلايا الليمفاوية أحادية النواة في الدم المحيطي. بروتوكول الوسم المغناطيسي والتخصيب: 1. تحضير محلول BD IMag™ بتركيز 1X: خفف محلول BD IMag™ (10X) (رقم المنتج 552362) بنسبة 1:10 باستخدام ماء مقطر معقم، أو حضّر محلول ملحي مُخفَّف بالفوسفات (PBS) مُدعَّم بـ 0.5% من ألبومين المصل البقري (BSA)، و2 ملي مول من ثنائي أمين الإيثيلين رباعي حمض الأسيتيك (EDTA)، و0.1% من أزيد الصوديوم. ٢. حضّر الخلايا الليمفاوية أحادية النواة من الدم البشري المعالج بمضادات التخثر، ويفضل استخدام تقنية الطرد المركزي بتدرج الكثافة باستخدام محلول فيكول-باك™.* ٣. أزل تجمعات الخلايا و/أو الحطام بتمرير المعلق عبر مصفاة خلايا من النايلون بمسام ٧٠ ميكرومتر. عدّ الخلايا، وأعد تعليقها في محلول BD IMag™ بتركيز ١٠ × ١٠^٦ خلية/مل. ٤. أضف ٥ ميكرولتر من مزيج إثراء الخلايا الليمفاوية البائية البشرية المبيوتينية لكل ١ × ١٠^٦ خلية، وحضّنها في درجة حرارة الغرفة لمدة ١٥ دقيقة.† ٥. اغسل الخلايا الموسومة بحجم زائد ١٠ أضعاف من محلول BD IMag™، ثم افصلها بالطرد المركزي عند ٣٠٠ × g لمدة ٧ دقائق، واسحب كل السائل الطافي بعناية. ٦. رجّ محلول BD IMag™ Streptavidin Particles Plus - DM جيدًا، وأضف ٥ ميكرولتر من الجسيمات لكل ١ × ١٠^٦ خلية. ٧. اخلط جيدًا. حضّن في درجة حرارة الغرفة لمدة ٣٠ دقيقة.† ٨. ارفع حجم الوسم إلى تركيز ٢٠-٨٠ × ١٠^٦ خلية/مل باستخدام محلول BD IMag™ المخفف ١X. ٩. انقل الخلايا الموسومة إلى أنبوب اختبار ذي قاع مستدير ١٢ × ٧٥ مم، بحيث لا يتجاوز الحجم المضاف ١.٠ مل. ضع أنبوب الجزء الموجب هذا على مغناطيس فصل الخلايا (في الوضع الأفقي) لمدة ٦ إلى ٨ دقائق. - للحصول على حجم أكبر، انقل الخلايا إلى أنبوب اختبار ذي قاع مستدير ١٧ × ١٠٠ مم، بحيث لا يتجاوز الحجم المضاف ٣.٠ مل. ضع أنبوب الجزء الموجب هذا على مغناطيس فصل الخلايا (في الوضع الرأسي) لمدة ٨ دقائق. ١٠. مع وضع الأنبوب على مغناطيس فصل الخلايا، وباستخدام ماصة باستور زجاجية معقمة، اسحب السائل الطافي (الجزء المُخصب) بعناية وضعه في أنبوب معقم جديد. ١١. أخرج أنبوب الجزء الموجب من مغناطيس فصل الخلايا، وأضف محلول BD IMag™ بتركيز ١X إلى نفس الحجم كما في الخطوة ٨. أعد تعليق الجزء الموجب عن طريق السحب والمُضخة من ١٠ إلى ١٥ مرة، ثم أعد الأنبوب إلى مغناطيس فصل الخلايا لمدة ٦ إلى ٨ دقائق. - بالنسبة لأنبوب ١٧ × ١٠٠ مم: ضعه على مغناطيس فصل الخلايا لمدة ٨ دقائق. ١٢. باستخدام ماصة باستور معقمة جديدة، اسحب السائل الطافي بعناية واخلطه مع الجزء المُخصب من الخطوة ١٠ أعلاه. ١٣. كرر الخطوتين ١١ و١٢. يحتوي الجزء المُخصب المُدمج على خلايا ليمفاوية بائية بدون أجسام مضادة أو جزيئات مغناطيسية مرتبطة به. هذه الخلايا جاهزة للتطبيقات اللاحقة، أو يمكن زيادة تركيزها بالانتقال إلى الخطوة 15. 14. يمكن إعادة تعليق خلايا الجزء الموجب المتبقية في الأنبوب الأصلي في محلول منظم أو وسط زراعة مناسب للتطبيقات اللاحقة، بما في ذلك قياس التدفق الخلوي، إذا لزم الأمر. 15. اختياري: إذا كان لدى المتبرع نسبة منخفضة من الخلايا الليمفاوية البائية، يمكن زيادة نقاء الجزء المُركّز بنسبة 2-8% إضافية (قارن بين اللوحتين السفليتين الوسطى واليمنى في الشكل) بوضع الأنبوب الذي يحتوي على الجزء المُركّز على مغناطيس فصل الخلايا لمدة 6 إلى 8 دقائق إضافية. - بالنسبة لأنبوب 17 × 100 مم: ضعه على مغناطيس فصل الخلايا لمدة 8 دقائق. 16. اسحب السائل الطافي (الجزء المُركّز مرتين) بعناية وضعه في أنبوب معقم جديد للتطبيق اللاحق. ١٧. حلل عينات من معلق الخلايا الكلي، والكسور الموجبة والمُخصبة لتقييم كفاءة عملية فصل الخلايا. ملاحظات: * نصائح لتحضير الخلايا بنجاح: o اسحب الدم في أنبوب يحتوي على EDTA o أزل البلازما الغنية بالصفائح الدموية عن طريق الطرد المركزي مرة واحدة عند ٢٢٠-٢٤٠ × g. o اغسل ٢-٣ مرات في محلول PBS بعد فصل التدرج الكثافي. o بعد الغسلة الأخيرة، أعد تعليق الخلايا بتركيز عالٍ نسبيًا في محلول BD IMag™ 1X وانتقل إلى الخطوة ٣. † تجنب الوسم غير المحدد بالعمل بسرعة والالتزام بأوقات الحضانة الموصى بها.
إشعارات المنتج: مصدر جميع بروتينات المصل هو مسالخ معتمدة من وزارة الزراعة الأمريكية، وتقع في الولايات المتحدة. تحذير: ينتج أزيد الصوديوم حمض الهيدرازويك شديد السمية في الظروف الحمضية. خفف مركبات الأزيد بالماء الجاري قبل التخلص منها لتجنب تراكم رواسب قابلة للانفجار في أنابيب الصرف الصحي. تُحضّر جزيئات BD IMag™ من جزيئات مغناطيسية مُعدّلة بمجموعات الكربوكسيل، وهي من إنتاج شركة Skold Technology، ومرخصة بموجب براءة الاختراع الأمريكية رقم 7,169,618. للاطلاع على أطياف الفلوركروم وإعدادات الجهاز المناسبة، يُرجى زيارة صفحة قياس التدفق الخلوي متعدد الألوان على موقعنا الإلكتروني www.bdbiosciences.com/colors. Ficoll-Paque هي علامة تجارية مسجلة لشركة Amersham Biosciences Limited. يُرجى زيارة www.bdbiosciences.com/us/s/resources للاطلاع على البروتوكولات الفنية.
الوصف: معرف EntrezGene
غير متاح : غير متاح