BD، 558420، مجموعة إثراء الخلايا المتغصنة البشرية BD IMag™ - DM

التفاعل: بشري (تم الإبلاغ عنه)
التطبيق: فصل الخلايا (يتم اختباره بشكل روتيني)
الوضع التنظيمي: للاستخدام البحثي فقط
RRID: AB_2869175
الوصف: تُستخدم مجموعة BD IMag™ لإثراء الخلايا المتغصنة البشرية - DM للاختيار السلبي للخلايا المتغصنة (DC) من الدم المحيطي. يحتوي مزيج إثراء الخلايا المتغصنة البشرية على أجسام مضادة أحادية النسيلة مُؤشَّرة بالبيوتين، والتي تتعرف على المستضدات الموجودة على كريات الدم الحمراء والصفائح الدموية وكريات الدم البيضاء المحيطية غير المتغصنة. أما جزيئات BD IMag™ Streptavidin Particles Plus - DM فهي جزيئات نانوية مغناطيسية مرتبطة تساهميًا بالستربتافيدين على أسطحها. بفضل هذين المكونين، تتجنب مجموعة BD IMag™ لإثراء الخلايا المتغصنة البشرية - DM التنشيط غير المقصود للخلايا المتغصنة المُثرية، وذلك باستخدام كواشف لا ترتبط مباشرةً بتلك الخلايا. تم تحسين هذه المجموعة للاستخدام مع مغناطيس فصل الخلايا BD IMag™، وتحتوي على كمية كافية من الكواشف لتمييز 10^9 خلية أحادية النواة في الدم المحيطي (PBMC). يتكون مزيج إثراء الخلايا المتغصنة البشرية، سعة 5.0 مل، من الأجسام المضادة وحيدة النسيلة التالية المرتبطة بالبيوتين: بيوتين فأر مضاد لـ CD3 البشري، المستنسخ UCHT1؛ بيوتين فأر مضاد لـ CD14 البشري، المستنسخ M5E2؛ بيوتين فأر مضاد لـ CD19 البشري، المستنسخ HIB19؛ بيوتين فأر مضاد لـ CD41a البشري، المستنسخ HIP8؛ بيوتين فأر مضاد لـ CD56 البشري، المستنسخ B159؛ بيوتين فأر مضاد لـ CD66b البشري، المستنسخ G10F5؛ بيوتين فأر مضاد لـ CD235a البشري (جليكوبروتين أ)، المستنسخ GA-R2 (HIR2)؛ بيوتين فأر مضاد لـ IgE البشري، المستنسخ G7-26
التحضير والتخزين: يُحفظ غير مخفف عند درجة حرارة 4 درجات مئوية. تم تنقية الجسم المضاد أحادي النسيلة من سائل مزرعة الأنسجة أو السائل الاستسقائي باستخدام كروماتوغرافيا التقارب. تم ربط الجسم المضاد أو الستربتافيدين بالجسيمات المغناطيسية في ظل الظروف المثلى، وتمت إزالة الجسم المضاد/الستربتافيدين غير المرتبط.
إجراءات الفحص الموصى بها: فيما يلي بروتوكول الوسم المغناطيسي والإثراء المفصل. باختصار، يقوم مزيج إثراء الخلايا المتغصنة البشرية بتلوين كريات الدم الحمراء والصفائح الدموية ومعظم كريات الدم البيضاء باستثناء الخلايا المتغصنة. بعد غسل الأجسام المضادة الزائدة، تُضاف جزيئات BD IMag™ Streptavidin Particles Plus - DM إلى معلق الخلايا، حيث ترتبط بالخلايا الحاملة للأجسام المضادة المُؤشَّرة بالبيوتين. ثم يُوضع الأنبوب الذي يحتوي على معلق الخلايا الموسوم داخل المجال المغناطيسي لجهاز فصل الخلايا المغناطيسي BD IMag™ (رقم المنتج 552311). بعد ذلك، تُجرى عملية اختيار سلبي لإثراء الخلايا المتغصنة غير الموسومة. تهاجر الخلايا الموسومة نحو المغناطيس (الجزء الموجب)، تاركةً الخلايا غير الموسومة في المعلق ليتم سحبها والاحتفاظ بها (الجزء المُثرى). تُكرر عملية الاختيار السلبي مرتين لزيادة كمية الجزء المُثرى. في حال الحاجة إلى نقاء أعلى، يمكن إجراء عملية اختيار سلبي على الجزء المُثرى. لتوضيح الإجراء، تم رسم خطوات الفصل المغناطيسي في مخطط انسيابي للإثراء. يمكن تقييم الأجزاء الموجبة والمُثرية في تطبيقات لاحقة مثل قياس التدفق الخلوي وزراعة الأنسجة. تم تحسين الأجسام المضادة المُؤشَّرة بالبيوتين في مزيج إثراء الخلايا المتغصنة البشرية وتخفيفها مسبقًا لتوفير أقصى كفاءة لإثراء الخلايا المتغصنة من الخلايا أحادية النواة في الدم المحيطي. بروتوكول الوسم المغناطيسي والإثراء: 1. تحضير محلول BD IMag™ بتركيز 1X: خفف محلول BD IMag™ (10X) (رقم المنتج 552362) بنسبة 1:10 باستخدام ماء مقطر معقم أو حضّر محلول ملحي مُخفَّف بالفوسفات (PBS) مُدعَّم بـ 0.5% من ألبومين المصل البقري (BSA) و2 ملي مول من حمض الإيثيلين ديامين رباعي الأسيتيك (EDTA) و0.1% من أزيد الصوديوم. ٢. حضّر الخلايا الليمفاوية أحادية النواة من الدم البشري المعالج بمضادات التخثر، ويفضل استخدام تقنية الطرد المركزي بتدرج الكثافة باستخدام محلول فيكول-باك™. ٣. أزل تجمعات الخلايا و/أو الحطام بتمرير المعلق عبر مصفاة خلايا من النايلون بمسام ٧٠ ميكرومتر. عدّ الخلايا، وأعد تعليقها في محلول BD IMag™ بتركيز ٥٠ × ١٠⁶ خلية/مل. ٤. أضف ٥ ميكرولتر من مزيج إثراء الخلايا المتغصنة البشرية لكل ١ × ١٠⁶ خلية، وحضّنها في درجة حرارة الغرفة لمدة ١٥ دقيقة.† ٥. اغسل الخلايا الموسومة بحجم زائد ١٠ أضعاف من محلول BD IMag™، ثم افصلها بالطرد المركزي عند ٣٠٠ × g لمدة ٧ دقائق، واسحب كل السائل الطافي بعناية. ٦. رجّ محلول BD IMag™ Streptavidin Particles Plus - DM جيدًا، ثم أعد تعليق الخلايا في ٧.٥ ميكرولتر من الجسيمات لكل ١ × ١٠⁶ خلية. يُرجى ملاحظة أن حجم جسيمات IMag Streptavidin هذا أكبر من الحجم المستخدم في معظم مجموعات إثراء BD IMag، وأن مجموعة إثراء الخلايا المتغصنة البشرية - DM تحتوي على حجم إجمالي أكبر من هذه الجسيمات لتعويض هذا الاختلاف. ٧. امزج جيدًا. حضّن في درجة حرارة الغرفة لمدة ٣٠ دقيقة.† ٨. ارفع حجم الوسم إلى تركيز من ٢٠ إلى ٨٠ × ١٠⁶ خلية/مل باستخدام محلول BD IMag™ المخفف ١X. ٩. انقل الخلايا الموسومة إلى أنبوب اختبار ذي قاع مستدير ١٢ × ٧٥ مم، بحيث لا يتجاوز الحجم المضاف ١.٠ مل. ضع أنبوب الجزء الموجب هذا على مغناطيس فصل الخلايا (في الوضع الأفقي) لمدة 6 إلى 8 دقائق. • للحصول على حجم أكبر، قسّم الخلايا إلى عدة أنابيب اختبار ذات قاع مستدير بأبعاد 12 × 75 مم، أو انقل الخلايا إلى أنبوب اختبار ذي قاع مستدير بأبعاد 17 × 100 مم، على ألا يتجاوز الحجم المضاف 3.0 مل. ضع أنبوب الجزء الموجب هذا على مغناطيس فصل الخلايا (في الوضع الرأسي) لمدة 8 دقائق. 10. مع بقاء الأنبوب على مغناطيس فصل الخلايا، وباستخدام ماصة باستور زجاجية معقمة، اسحب السائل الطافي (الجزء المُخصب) بعناية وضعه في أنبوب معقم جديد. ١١. أخرج أنبوب الجزء الموجب من جهاز فصل الخلايا المغناطيسي، وأضف محلول BD IMag™ بتركيز 1X بنفس الحجم كما في الخطوة ٨. أعد تعليق الجزء الموجب جيدًا عن طريق سحبه ودفعه بالماصة من ١٠ إلى ١٥ مرة (مع تجنب تكوّن الفقاعات)، ثم أعد الأنبوب إلى جهاز فصل الخلايا المغناطيسي لمدة ٦ إلى ٨ دقائق. • بالنسبة لأنبوب ١٧ × ١٠٠ مم: ضعه على جهاز فصل الخلايا المغناطيسي لمدة ٨ دقائق. ١٢. باستخدام ماصة باستور معقمة جديدة، اسحب السائل الطافي بحرص واخلطه مع الجزء المُخصّب من الخطوة ١٠ أعلاه. ١٣. كرر الخطوتين ١١ و١٢. يحتوي الجزء المُخصّب المُدمج على خلايا متغصنة خالية من الأجسام المضادة أو الجسيمات المغناطيسية المرتبطة بها. ١٤. لزيادة نقاء الجزء المُخصّب المُدمج، ضع الأنبوب الذي يحتوي على الجزء المُخصّب المُدمج على جهاز فصل الخلايا المغناطيسي لمدة ١٠ دقائق أخرى. • لأنبوب 17 × 100 مم: ضعه على مغناطيس فصل الخلايا لمدة 10 دقائق. 15. اسحب السائل الطافي بعناية وضعه في أنبوب معقم جديد. هذا هو الجزء المُخصب مرتين. الخلايا جاهزة للمعالجة في التطبيقات اللاحقة. 16. يمكن إعادة تعليق خلايا الجزء الموجب المتبقية في الأنبوب الأصلي في محلول منظم مناسب أو وسط زراعة للتطبيقات اللاحقة، بما في ذلك قياس التدفق الخلوي، إذا رغبت في ذلك. 17. يجب تحليل عينات من معلق الخلايا الكلي والأجزاء الموجبة والمُخصبة بواسطة قياس التدفق الخلوي لتقييم كفاءة إجراء فصل الخلايا. ملاحظات: • اسحب الدم في أنبوب يحتوي على EDTA. • أزل البلازما الغنية بالصفائح الدموية عن طريق الطرد المركزي مرة واحدة عند 220-240 × g. • اغسل 2-3 مرات في محلول ملحي فوسفاتي بعد فصل تدرج الكثافة. • بعد الغسلة النهائية، أعد تعليق الخلايا بتركيز عالٍ نسبيًا في محلول BD IMag™ 1X وانتقل إلى الخطوة 3. † تجنب وضع العلامات غير المحددة من خلال العمل بسرعة والالتزام بأوقات الحضانة الموصى بها.
إشعارات المنتج: مصدر جميع بروتينات المصل هو مسالخ معتمدة من وزارة الزراعة الأمريكية، وتقع في الولايات المتحدة. تحذير: ينتج أزيد الصوديوم حمض الهيدرازويك شديد السمية في الظروف الحمضية. خفف مركبات الأزيد بالماء الجاري قبل التخلص منها لتجنب تراكم رواسب قابلة للانفجار في أنابيب الصرف الصحي. تُحضّر جزيئات BD IMag™ من جزيئات مغناطيسية مُعدّلة بمجموعات الكربوكسيل، تُصنّعها شركة Skold Technology، وهي مرخصة بموجب براءة الاختراع الأمريكية رقم 7,169,618. Ficoll-Paque هي علامة تجارية مسجلة لشركة Amersham Biosciences Limited. يُرجى مراجعة www.bdbiosciences.com/us/s/resources للاطلاع على البروتوكولات الفنية.
الوصف: معرف EntrezGene
غير متاح : غير متاح