BD، 558454، مجموعة إثراء الخلايا الوحيدة البشرية BD IMag™ - DM

التفاعل: بشري (اختبار مراقبة الجودة)
التطبيق: فصل الخلايا (يتم اختباره بشكل روتيني)
الوضع التنظيمي: للاستخدام البحثي فقط
RRID: AB_2869179
الوصف: تُستخدم مجموعة BD IMag™ لإثراء الخلايا الوحيدة البشرية - DM للاختيار السلبي للخلايا الوحيدة من الدم المحيطي. يحتوي مزيج إثراء الخلايا الوحيدة البشرية (المكون 51-9004592) على أجسام مضادة وحيدة النسيلة مُؤشَّرة بالبيوتين، والتي تتعرف على المستضدات الموجودة على كريات الدم الحمراء وكريات الدم البيضاء المحيطية. يتكون مزيج إثراء الخلايا الوحيدة البشرية (المكون 51-9004592) من الأجسام المضادة التالية المُقترنة بالبيوتين والمُضادة للخلايا الوحيدة البشرية: CD3 (النسيلة UCHT1)، وCD45RA (النسيلة HI100)، وCD19 (النسيلة HIB19)، وCD56 (النسيلة B159)، وCD235a (GA-R2). كما يتضمن كاشفًا إضافيًا (المكون 51-9004594)، وهو جسم مضاد مُؤشَّر بالبيوتين من الفئران مُضاد لـ CD41a البشري، مما يتيح للباحثين خيار إزالة الصفائح الدموية. تميل الصفائح الدموية إلى الالتصاق بالخلايا الوحيدة، ولذلك قد يؤدي إضافة CD41a إلى تقليل عدد الخلايا الوحيدة بعد عملية التخصيب، ولكن ستكون مجموعة الخلايا الوحيدة الناتجة أكثر نقاءً مما لو لم يُضَف الجسم المضاد CD41a البشري. جزيئات BD IMag™ Streptavidin Particles Plus - DM (المكون 51-9000810) عبارة عن جسيمات نانوية مغناطيسية مرتبطة تساهميًا بالستربتافيدين على أسطحها. تم تحسين مجموعة BD IMag™ Human Monocyte Enrichment Set - DM للاستخدام مع مغناطيس فصل الخلايا BD IMag™، وتحتوي على كمية كافية من الكواشف لوسم 10^9 خلية أحادية النواة في الدم المحيطي (PBMC).
التحضير والتخزين: يُحفظ غير مخفف عند درجة حرارة 4 درجات مئوية. تم تنقية الجسم المضاد أحادي النسيلة من سائل مزرعة الأنسجة أو السائل الاستسقائي باستخدام كروماتوغرافيا التقارب. تم ربط الجسم المضاد أو الستربتافيدين بالجسيمات المغناطيسية في ظل الظروف المثلى، وتمت إزالة الجسم المضاد/الستربتافيدين غير المرتبط.
إجراءات التحليل الموصى بها: باختصار، عند إضافة مزيج إثراء الخلايا الوحيدة البشرية إلى العينة، فإنه يصبغ كريات الدم الحمراء ومعظم كريات الدم البيضاء في آنٍ واحد، مما ينتج عنه مجموعة غنية من الخلايا الوحيدة. تتيح إضافة الجسم المضاد الاختياري المُرتبط بالبيوتين والموجه ضد CD41a البشري إمكانية إزالة الصفائح الدموية. بعد غسل العينة لإزالة أي فائض من الأجسام المضادة، تُضاف جزيئات BD IMag™ Streptavidin Particles Plus - DM إلى معلق الخلايا، حيث ترتبط بالخلايا الحاملة للأجسام المضادة المُرتبطة بالبيوتين. ثم يُوضع الأنبوب الذي يحتوي على معلق الخلايا المُوسومة داخل المجال المغناطيسي لجهاز فصل الخلايا المغناطيسي BD IMag™. بعد ذلك، تُجرى عملية اختيار سلبي لإثراء الخلايا الوحيدة غير المُوسومة. تهاجر الخلايا المُوسومة بالستربتافيدين نحو المغناطيس (وتُسمى الجزء الموجب)، تاركةً الخلايا غير المُوسومة في المعلق ليتم سحبها والاحتفاظ بها (وتُسمى الجزء المُثرى). تُكرر عملية الاختيار السلبي مرتين لزيادة كمية الجزء المُثرى. في حال الحاجة إلى نقاء أعلى، يمكن إجراء عملية فصل سلبي على الجزء المُخصب. يوضح مخطط انسيابي التخصيب تمثيلًا بيانيًا لإجراء الفصل المغناطيسي الموصوف. تم تحسين الأجسام المضادة المُؤشَّرة بالبيوتين في مزيج تخصيب الخلايا الوحيدة البشرية وتخفيفها مسبقًا لتحقيق أقصى كفاءة في تخصيب الخلايا الوحيدة من الخلايا أحادية النواة في الدم المحيطي. بروتوكول الوسم المغناطيسي والتخصيب: 1. تحضير محلول BD IMag™ بتركيز 1X: خفف محلول BD IMag™ (10X) (رقم المنتج 552362) بنسبة 1:10 باستخدام ماء مقطر معقم، أو حضّر محلول ملحي مُخفَّف بالفوسفات (PBS) مُدعَّم بـ 0.5% من ألبومين المصل البقري (BSA)، و2 ملي مول من ثنائي أمين الإيثيلين رباعي حمض الأسيتيك (EDTA)، و0.1% من أزيد الصوديوم. ٢. حضّر الخلايا الليمفاوية أحادية النواة من الدم البشري المعالج بمضادات التخثر، ويفضل استخدام تقنية الطرد المركزي بتدرج الكثافة باستخدام محلول فيكول-باك™.* ٣. أزل تجمعات الخلايا و/أو الحطام بتمرير المعلق عبر مصفاة خلايا من النايلون بمسام ٧٠ ميكرومتر. عدّ الخلايا، وأعد تعليقها في محلول BD IMag™ بتركيز ١٠ × ١٠⁶ خلية/مل. ٤. أضف ٥ ميكرولتر من مزيج إثراء الخلايا الوحيدة البشرية لكل ١ × ١٠⁶ خلية، واحضنها في درجة حرارة الغرفة لمدة ١٥ دقيقة.† اختياري: أضف ٥ ميكرولتر من الجسم المضاد البيوتين الفأري المضاد لـ CD41a البشري لكل ١ × ١٠⁶ خلية. ٥. اغسل الخلايا الموسومة بحجم زائد ١٠ أضعاف من محلول BD IMag™، ثم افصلها بالطرد المركزي عند ٣٠٠ × جم لمدة ٧ دقائق، واسحب كل السائل الطافي بعناية. ٦. رجّ محلول BD IMag™ Streptavidin Particles Plus - DM جيدًا، ثم أعد تعليق الخلايا في ٥ ميكرولتر من الجسيمات لكل ١ × ١٠⁶ خلية. ٧. اخلط جيدًا. حضّن في درجة حرارة الغرفة لمدة ٣٠ دقيقة.† ٨. ارفع حجم الوسم إلى ٢٠-٨٠ × ١٠⁶ خلية/مل باستخدام محلول BD IMag™ المخفف ١X. ٩. انقل الخلايا الموسومة إلى أنبوب اختبار ذي قاع مستدير ١٢ × ٧٥ مم، بحيث لا يتجاوز الحجم المضاف ١.٠ مل. ضع أنبوب الجزء الموجب هذا على مغناطيس فصل الخلايا (في الوضع الأفقي) لمدة ٦ إلى ٨ دقائق. - للحصول على حجم أكبر، انقل الخلايا إلى أنبوب اختبار ذي قاع مستدير ١٧ × ١٠٠ مم، بحيث لا يتجاوز الحجم المضاف ٣.٠ مل. ضع أنبوب الجزء الموجب على مغناطيس فصل الخلايا (في الوضع الرأسي) لمدة 8 دقائق. 10. مع بقاء الأنبوب على مغناطيس فصل الخلايا، وباستخدام ماصة باستور زجاجية معقمة، اسحب السائل الطافي (الجزء المُخصب) بعناية وضعه في أنبوب معقم جديد. 11. أزل أنبوب الجزء الموجب من مغناطيس فصل الخلايا، وأضف محلول BD IMag™ بتركيز 1X إلى نفس الحجم كما في الخطوة 8. أعد تعليق الجزء الموجب جيدًا عن طريق السحب والدفع بالماصة من 10 إلى 15 مرة، ثم أعد الأنبوب إلى مغناطيس فصل الخلايا لمدة 6 إلى 8 دقائق. - بالنسبة لأنبوب 17 × 100 مم: ضعه على مغناطيس فصل الخلايا لمدة 8 دقائق. 12. باستخدام ماصة باستور معقمة جديدة، اسحب السائل الطافي بعناية واخلطه مع الجزء المُخصب من الخطوة 10 أعلاه. ١٣. كرر الخطوتين ١١ و١٢. يحتوي الجزء المُخصب المُجمع على خلايا وحيدة النواة خالية من الأجسام المضادة أو الجسيمات المغناطيسية المرتبطة بها. ١٤. لزيادة نقاء الجزء المُخصب المُجمع بنسبة ٥٪ أو أكثر (قارن بين اللوحتين الوسطى اليسرى واليمنى في الشكل)، ضع الأنبوب الذي يحتوي على الجزء المُخصب المُجمع على مغناطيس فصل الخلايا لمدة ١٠ دقائق إضافية. - بالنسبة لأنبوب ١٧ × ١٠٠ مم: ضعه على مغناطيس فصل الخلايا لمدة ١٠ دقائق. ١٥. اسحب السائل الطافي بعناية وضعه في أنبوب معقم جديد. هذا هو الجزء المُخصب مرتين. الخلايا جاهزة للمعالجة في التطبيقات اللاحقة. ١٦. يمكن إعادة تعليق خلايا الجزء الموجب المتبقية في الأنبوب الأصلي في محلول منظم مناسب أو وسط زراعة للتطبيقات اللاحقة، بما في ذلك قياس التدفق الخلوي، إذا رغبت في ذلك. ١٧. يجب تحليل عينات من معلق الخلايا الكلي والأجزاء الموجبة والمُخصبة باستخدام قياس التدفق الخلوي لتقييم كفاءة عملية فصل الخلايا. ملاحظات: * نصائح لتحضير الخلايا بنجاح: اسحب الدم في أنبوب يحتوي على EDTA. أزل البلازما الغنية بالصفائح الدموية عن طريق الطرد المركزي مرة واحدة عند ٢٢٠-٢٤٠ × g. اغسل ٢-٣ مرات في محلول PBS بعد فصل التدرج الكثافي. بعد الغسلة الأخيرة، أعد تعليق الخلايا بتركيز عالٍ نسبيًا في محلول BD IMag™ 1X، ثم انتقل إلى الخطوة ٣. † تجنب التلوين غير المحدد بالعمل بسرعة والالتزام بأوقات الحضانة الموصى بها.
إشعارات المنتج: تُحضّر جزيئات BD IMag™ من جزيئات مغناطيسية مُعدّلة بمجموعات الكربوكسيل، تُصنّعها شركة Skold Technology بموجب ترخيص براءة الاختراع الأمريكية رقم 7,169,618. مصدر جميع بروتينات المصل هو مسالخ معتمدة من وزارة الزراعة الأمريكية، تقع في الولايات المتحدة. تحذير: ينتج أزيد الصوديوم حمض الهيدرازويك شديد السمية في الظروف الحمضية. لذا، يُرجى تخفيف مركبات الأزيد بالماء الجاري قبل التخلص منها لتجنب تراكم رواسب قابلة للانفجار في أنابيب الصرف الصحي. Ficoll-Paque هي علامة تجارية مسجلة لشركة Amersham Biosciences Limited. يُرجى مراجعة الموقع الإلكتروني www.bdbiosciences.com/us/s/resources للاطلاع على البروتوكولات الفنية.
الوصف: معرف EntrezGene
غير متاح : غير متاح