BD، 558471، مجموعة إثراء الخلايا اللمفاوية التائية CD8 للفئران BD IMag™ - DM

التطبيق: فصل الخلايا (يتم اختباره بشكل روتيني)
الوضع التنظيمي: للاستخدام البحثي فقط
RRID: AB_2869195
الوصف: تُستخدم مجموعة BD IMag™ Mouse CD8 T Lymphocyte Enrichment Set - DM للاختيار السلبي للخلايا اللمفاوية التائية CD8 من طحال أو عقدة لمفاوية للفأر. يحتوي كوكتيل Biotinylated Mouse CD8 T Lymphocyte Enrichment Cocktail على أجسام مضادة وحيدة النسيلة تتعرف على المستضدات الموجودة على كريات الدم الحمراء والبيضاء الطرفية التي لا تُعد خلايا لمفاوية تائية CD8. أما جزيئات BD IMag Streptavidin Particles Plus - DM فهي جزيئات نانوية مغناطيسية مرتبطة تساهميًا بالستربتافيدين على أسطحها. بفضل هذين المكونين، تتجنب مجموعة BD IMag Mouse CD8 T Lymphocyte Enrichment Set - DM التنشيط غير المقصود للخلايا اللمفاوية التائية CD8 المُثرية، وذلك باستخدام كواشف لا ترتبط مباشرةً بتلك الخلايا. لم يتم اختبارها على خلايا الفأر المُنشطة. تم تحسين هذه المجموعة للاستخدام مع مغناطيس فصل الخلايا BD IMag™، وتحتوي على كمية كافية من الكواشف لوسم 10^9 من الكريات البيضاء. يتكون مكون كوكتيل إثراء الخلايا اللمفاوية التائية CD8 من الأجسام المضادة وحيدة النسيلة التالية المرتبطة بالبيوتين: مضاد CD4 للفأر، المستنسخ GK1.5؛ مضاد CD11b للفأر، المستنسخ M1/70؛ مضاد CD45R/B220 للفأر، المستنسخ RA3-6B2؛ مضاد CD49b للفأر، المستنسخ HMα2؛ مضاد TER-119/الخلايا الحمراء للفأر، المستنسخ TER-119.
التحضير والتخزين: يُحفظ غير مخفف عند درجة حرارة 4 درجات مئوية. تم تنقية الجسم المضاد أحادي النسيلة من سائل مزرعة الأنسجة أو السائل الاستسقائي باستخدام كروماتوغرافيا التقارب. تم ربط الجسم المضاد بالبيوتين في ظل الظروف المثلى، وتمت إزالة البيوتين غير المتفاعل. تم ربط الجسم المضاد أو الستربتافيدين بالجسيمات المغناطيسية في ظل الظروف المثلى، وتمت إزالة الجسم المضاد/الستربتافيدين غير المرتبط.
إجراءات الفحص الموصى بها: فيما يلي بروتوكول الوسم المغناطيسي والإثراء المفصل. باختصار، يقوم كوكتيل إثراء الخلايا اللمفاوية التائية CD8 الفأرية المُوسومة بالبيوتين بتلوين كريات الدم الحمراء ومعظم كريات الدم البيضاء باستثناء الخلايا اللمفاوية التائية CD8. بعد غسل الأجسام المضادة الزائدة، تُضاف جزيئات BD IMag Streptavidin Particles Plus - DM إلى معلق الخلايا، حيث ترتبط بالخلايا الحاملة للأجسام المضادة المُوسومة بالبيوتين. ثم يُوضع الأنبوب الذي يحتوي على معلق الخلايا الموسوم داخل المجال المغناطيسي لجهاز فصل الخلايا المغناطيسي (رقم المنتج 552311). بعد ذلك، يُجرى اختيار سلبي لإثراء الخلايا التائية CD8 غير الموسومة. تهاجر الخلايا الموسومة نحو المغناطيس (الجزء الموجب)، تاركةً الخلايا غير الموسومة في المعلق ليتم سحبها والاحتفاظ بها (الجزء المُثرى). يُكرر الاختيار السلبي مرتين لزيادة كمية الجزء المُثرى. في حال الحاجة إلى نقاء أعلى، يمكن إجراء الاختيار السلبي على الجزء المُثرى. لتوضيح الإجراء، تم رسم خطوات الفصل المغناطيسي في مخطط انسيابي للإثراء. يمكن تقييم الأجزاء الموجبة والمُثرية في تطبيقات لاحقة مثل قياس التدفق الخلوي وزراعة الأنسجة. تم تحسين الأجسام المضادة في كوكتيل إثراء الخلايا اللمفاوية التائية CD8 المُؤشَّرة بالبيوتين للفأر وتخفيفها مسبقًا لتوفير أقصى كفاءة لإثراء الخلايا اللمفاوية التائية CD8 من الأعضاء اللمفاوية المحيطية. بروتوكول الوسم والإثراء المغناطيسي 1. يمكن إجراء جميع خطوات الوسم والإثراء إما في وسط زراعة الأنسجة أو في محلول BD™ IMag المعقم بتركيز 1X. - لتحضير محلول BD IMag بتركيز 1X: خفف محلول BD™ IMag (10X) (رقم المنتج 552362) بنسبة 1:10 باستخدام ماء مقطر معقم، أو حضّر محلول ملحي مُخفّف بالفوسفات مُدعّم بـ 0.5% من ألبومين المصل البقري (BSA)، و2 ملي مول من EDTA، و0.1% من أزيد الصوديوم، واحفظه في درجة حرارة 4 درجات مئوية. 2. حضّر معلقًا خلويًا أحاديًا من النسيج اللمفاوي المحيطي المطلوب، مع مراعاة التعقيم. أزل تجمعات الخلايا و/أو الحطام بتمرير الخلايا المعلقة عبر مصفاة خلايا من النايلون بمسام 70 ميكرومتر. يمكن تحضير معلقات الخلايا في وسط زراعة الأنسجة أو محلول BD IMag بتركيز 1X. 3. عدّ الخلايا. إذا كان تركيز الخلايا يتراوح بين 10 × 10⁶ و20 × 10⁶ خلية/مل، فانتقل إلى الخطوة 3. أما إذا كان تركيز الخلايا أقل من 10 × 10⁶ خلية/مل، فقم بفصل الخلايا بالطرد المركزي وأعد تعليقها في وسط زراعة الأنسجة أو محلول BD IMag بتركيز 20 × 10⁶ خلية/مل. 4. أضف 5 ميكرولتر من مزيج إثراء الخلايا اللمفاوية التائية CD8 الفأرية المُعَلَّمة بيولوجيًا لكل 1 × 10⁶ خلية، وحضّنها على الجليد لمدة 15 دقيقة.† 5. اغسل الخلايا المُعَلَّمة بحجم زائد 10 أضعاف من وسط زراعة الأنسجة أو محلول BD IMag، ثم قم بالطرد المركزي عند 300 × g لمدة 7 دقائق، واسحب السائل الطافي بالكامل بعناية. ٦. رجّ محلول BD IMag Streptavidin Particles Plus - DM جيدًا، وأضف ٥ ميكرولتر من الجسيمات لكل ١ × ١٠^٦ خلية. ٧. اخلط جيدًا. ضعه في الثلاجة لمدة ٣٠ دقيقة عند درجة حرارة ٦-١٢ درجة مئوية.† ٨. ارفع حجم الوسم إلى تركيز ٢٠ إلى ٨٠ × ١٠^٦ خلية/مل باستخدام وسط زراعة الأنسجة أو محلول BD IMag المخفف ١X. ٩. انقل الخلايا الموسومة إلى أنبوب اختبار ذي قاع مستدير ١٢ × ٧٥ مم، بحيث لا يتجاوز الحجم المضاف ١.٠ مل. ١٠. ضع أنبوب الجزء الموجب هذا على مغناطيس فصل الخلايا (في الوضع الأفقي) لمدة ٦ إلى ٨ دقائق.† - للحصول على حجم أكبر، انقل الخلايا إلى أنبوب اختبار ذي قاع مستدير ١٧ × ١٠٠ مم، بحيث لا يتجاوز الحجم المضاف ٣.٠ مل. ضع أنبوب الجزء الموجب على مغناطيس فصل الخلايا (في الوضع الرأسي) لمدة 8 دقائق.† 11. مع بقاء الأنبوب على مغناطيس فصل الخلايا، وباستخدام ماصة باستور زجاجية معقمة، اسحب السائل الطافي (الجزء المُخصب) بعناية وضعه في أنبوب معقم جديد. 12. أزل أنبوب الجزء الموجب من مغناطيس فصل الخلايا، وأضف وسط زراعة الأنسجة أو محلول BD IMag بتركيز 1X بنفس الحجم كما في الخطوة 8. أعد تعليق الجزء الموجب جيدًا عن طريق السحب والدفع بالماصة من 10 إلى 15 مرة، ثم أعد الأنبوب إلى مغناطيس فصل الخلايا لمدة 6 إلى 8 دقائق.† - بالنسبة لأنبوب 17 × 100 مم: ضعه على مغناطيس فصل الخلايا لمدة 8 دقائق.† 13. باستخدام ماصة باستور معقمة جديدة، اسحب السائل الطافي بعناية واخلطه مع الجزء المُخصب من الخطوة 10 أعلاه. ١٤. كرر الخطوتين ١١ و١٢. يحتوي الجزء المُخصب المُجمع على خلايا ليمفاوية تائية CD8 خالية من الأجسام المضادة أو الجسيمات المغناطيسية المرتبطة بها. هذه الخلايا جاهزة للتطبيقات اللاحقة، أو يمكن زيادة نقائها بالانتقال إلى الخطوة ١٥. ١٥. يمكن إعادة تعليق خلايا الجزء الموجب المتبقية في الأنبوب الأصلي في محلول منظم أو وسط زراعة مناسب للتطبيقات اللاحقة، بما في ذلك قياس التدفق الخلوي، إذا لزم الأمر. ١٦. لزيادة نقاء الجزء المُخصب المُجمع بنسبة ٣٪ إلى ٥٪ إضافية (قارن بين اللوحتين الوسطى اليسرى واليمنى في الشكل)، ضع الأنبوب الذي يحتوي على الجزء المُخصب المُجمع على مغناطيس فصل الخلايا لمدة ٦ إلى ٨ دقائق أخرى.† - بالنسبة لأنبوب ١٧ × ١٠٠ مم: ضعه على مغناطيس فصل الخلايا لمدة ٨ دقائق.† ١٧. اسحب السائل الطافي بعناية وضعه في أنبوب معقم جديد. هذا هو الجزء المُخصب مرتين. الخلايا جاهزة للمعالجة للتطبيقات اللاحقة. ١٨. يجب تحليل عينات من معلق الخلايا الكلي والكسور الموجبة والمُخصبة باستخدام قياس التدفق الخلوي لتقييم كفاءة عملية فصل الخلايا. ملاحظات: تحتوي بعض أوساط زراعة الأنسجة على البيوتين، الذي قد يتداخل مع ارتباط جزيئات الستربتافيدين. نوصي باستخدام وسط دولبيكو الأساسي الأدنى (DMEM). † تجنب التلوين غير النوعي بالعمل بسرعة والالتزام بأوقات الحضانة الموصى بها.
إشعارات المنتج: مصدر جميع بروتينات المصل هو مسالخ معتمدة من وزارة الزراعة الأمريكية، وتقع في الولايات المتحدة. تحذير: ينتج أزيد الصوديوم حمض الهيدرازويك شديد السمية في الظروف الحمضية. خفف مركبات الأزيد بالماء الجاري قبل التخلص منها لتجنب تراكم رواسب قابلة للانفجار في أنابيب الصرف الصحي. تُحضّر جزيئات BD IMag™ من جزيئات مغناطيسية مُعدّلة وظيفيًا بمجموعة الكربوكسيل، وهي من إنتاج شركة Skold Technology، ومرخصة بموجب براءة الاختراع الأمريكية رقم 7,169,618. يُرجى مراجعة www.bdbiosciences.com/us/s/resources للاطلاع على البروتوكولات الفنية.
الوصف: معرف EntrezGene
غير متاح : غير متاح