BD، 560030، مجموعة استنزاف خلايا السلالة البشرية BD IMag™ - DM

التطبيق: فصل الخلايا (يتم اختباره بشكل روتيني)
الوضع التنظيمي: للاستخدام البحثي فقط
RRID: AB_2869285
الوصف: تُستخدم مجموعة BD IMag™ لاستنفاد خلايا السلالة البشرية - DM لاستنفاد خلايا الدم الناضجة، مثل الخلايا التائية، والخلايا البائية، والخلايا القاتلة الطبيعية، والصفائح الدموية، والخلايا الوحيدة، والخلايا المحببة، والخلايا الحمراء، من عينات خلايا الدم أحادية النواة الطرفية (PBMC)، ونخاع العظم، ودم الحبل السري. يتيح ذلك إثراء مجموعات الخلايا النادرة، مثل الخلايا الجذعية، والخلايا السلفية، والخلايا المتغصنة. يحتوي كوكتيل استنفاد خلايا السلالة البشرية على أجسام مضادة أحادية النسيلة مُؤشَّرة بالبيوتين، تتعرف على المستضدات الموجودة على الخلايا التائية، والخلايا البائية، والخلايا القاتلة الطبيعية، والخلايا الوحيدة، والخلايا المحببة، والصفائح الدموية، والخلايا الحمراء. أما جزيئات BD IMag™ Streptavidin Particles Plus - DM فهي جزيئات نانوية مغناطيسية مرتبطة تساهميًا بالستربتافيدين على أسطحها. بفضل هذين المكونين، يُمكن استخدام مجموعة BD IMag™ لاستنفاد خلايا السلالة البشرية - DM كأداة أساسية لإثراء الخلايا النادرة أو كأداة فرز مسبق قبل عملية قياس التدفق الخلوي. وبصفتها أداة فرز مسبق قبل قياس التدفق الخلوي، فإنها تُقلل وقت الفرز بشكل كبير، بالإضافة إلى زيادة استخلاص الخلايا المطلوبة. وقد صُممت هذه المجموعة خصيصًا للاستخدام مع مغناطيس فصل الخلايا BD IMag™، وتحتوي على كمية كافية من الكواشف لوسم 1 × 10^9 خلية أحادية النواة في الدم المحيطي (PBMC). يتألف مزيج استنزاف السلالة البشرية من الأجسام المضادة وحيدة النسيلة المُؤشَّرة بالبيوتين التالية: جسم مضاد فأري مُؤشَّر بالبيوتين ضد CD3 البشري، المستنسخ UCHT1؛ جسم مضاد فأري مُؤشَّر بالبيوتين ضد CD14 البشري، المستنسخ M5E2؛ جسم مضاد فأري مُؤشَّر بالبيوتين ضد CD16 البشري، المستنسخ 3G8؛ جسم مضاد فأري مُؤشَّر بالبيوتين ضد CD19 البشري، المستنسخ HIB19؛ جسم مضاد فأري مُؤشَّر بالبيوتين ضد CD41a البشري، المستنسخ HIP8؛ جسم مضاد فأري مُؤشَّر بالبيوتين ضد CD56 البشري، المستنسخ B159؛ جسم مضاد فأري مُؤشَّر بالبيوتين ضد جليكوبروتين A البشري، المستنسخ GA-R2.
التحضير والتخزين: يُحفظ غير مخفف عند درجة حرارة 4 درجات مئوية. تم تنقية الجسم المضاد أحادي النسيلة من سائل مزرعة الأنسجة أو السائل الاستسقائي باستخدام كروماتوغرافيا التقارب. تم ربط الجسم المضاد بالبيوتين في ظل الظروف المثلى، وتمت إزالة البيوتين غير المتفاعل. تم ربط الجسم المضاد أو الستربتافيدين بالجسيمات المغناطيسية في ظل الظروف المثلى، وتمت إزالة الجسم المضاد/الستربتافيدين غير المرتبط.
إجراءات الفحص الموصى بها: فيما يلي بروتوكول الوسم المغناطيسي والإثراء المفصل. باختصار، يقوم مزيج استنزاف خلايا السلالة البشرية بتلوين الخلايا التائية والبائية والخلايا القاتلة الطبيعية، والخلايا الوحيدة، والخلايا المحببة، والصفائح الدموية، والخلايا الحمراء في آنٍ واحد. بعد غسل الأجسام المضادة الزائدة، تُضاف جزيئات BD IMag™ Streptavidin Particles Plus - DM إلى معلق الخلايا، حيث ترتبط بالخلايا الحاملة للأجسام المضادة المُؤشَّرة بالبيوتين. ثم يُوضع الأنبوب الذي يحتوي على معلق الخلايا الموسوم داخل المجال المغناطيسي لجهاز فصل الخلايا المغناطيسي (رقم المنتج 552311). بعد ذلك، يُجرى اختيار سلبي لإثراء الخلايا الجذعية والخلايا السلفية غير الموسومة. تهاجر الخلايا الموسومة نحو المغناطيس (الجزء الموجب)، تاركةً الخلايا غير الموسومة في المعلق ليتم سحبها والاحتفاظ بها (الجزء المُثرى). يُكرر الاختيار السلبي مرتين لزيادة كمية الجزء المُثرى. في حال الحاجة إلى نقاء أعلى، يمكن إجراء الاختيار السلبي على الجزء المُثرى. لتوضيح الإجراء، تم رسم خطوات الفصل المغناطيسي في مخطط انسيابي للإثراء. يمكن تقييم الأجزاء الموجبة والمُثرية في تطبيقات لاحقة مثل قياس التدفق الخلوي وزراعة الأنسجة. تم تحسين الأجسام المضادة المُؤشَّرة بالبيوتين في كوكتيل استنزاف خلايا السلالة البشرية وتخفيفها مسبقًا لتوفير أقصى كفاءة لإثراء خلايا المجموعات النادرة مثل الخلايا الجذعية من الخلايا الليمفاوية أحادية النواة في الدم المحيطي. بروتوكول الوسم المغناطيسي والإثراء: 1. تحضير محلول BD IMag™ بتركيز 1X: خفف محلول BD IMag™ (10X) (رقم المنتج 552362) بنسبة 1:10 باستخدام ماء مقطر معقم أو حضّر محلول ملحي مُخفَّف بالفوسفات (PBS) مُدعَّم بـ 0.5% من ألبومين المصل البقري (BSA) و2 ملي مول من ثنائي أمين الإيثيلين رباعي حمض الأسيتيك (EDTA) و0.1% من أزيد الصوديوم. ٢. حضّر الخلايا الليمفاوية أحادية النواة من الدم البشري المعالج بمضاد التخثر EDTA، ويفضل استخدام تقنية الطرد المركزي بتدرج الكثافة باستخدام محلول فيكول-باك™.* ٣. عدّ الخلايا، وأعد تعليقها في محلول BD IMag™ بتركيز ٥٠ × ١٠^٦ خلية/مل. ٤. أضف ٥ ميكرولتر من مزيج استنزاف خلايا السلالة البشرية لكل مليون خلية، وحضّنها في درجة حرارة الغرفة لمدة ١٥ دقيقة.† ٥. اغسل الخلايا الموسومة بحجم زائد ١٠ أضعاف من محلول BD IMag™، ثم اطردها مركزيًا عند ٣٠٠ × جم لمدة ١٠ دقائق، واسحب السائل الطافي بالكامل بعناية. ٦. رجّ محلول BD IMag™ Streptavidin Particles Plus - DM جيدًا، وأعد تعليق الخلايا المترسبة بتركيز ٧.٥ ميكرولتر من الجسيمات لكل ١ × ١٠^٦ خلية. يرجى ملاحظة أن حجم جزيئات IMag Streptavidin في هذه المجموعة أكبر من الحجم المستخدم في معظم مجموعات إثراء BD IMag، وأن هذه المجموعة تحتوي على حجم إجمالي أكبر من هذه الجزيئات لتعويض هذا الاختلاف. 7. اخلط جيدًا. حضّن في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.† 8. ارفع حجم الوسم إلى تركيز 10-80 × 10^6 خلية/مل باستخدام محلول BD IMag™ المخفف 1X. 9. انقل الخلايا الموسومة إلى أنبوب اختبار ذي قاع مستدير 12 × 75 مم، بحيث لا يتجاوز الحجم المضاف 1.0 مل. ضع هذا الأنبوب على مغناطيس فصل الخلايا (في الوضع الأفقي) لمدة 6 إلى 8 دقائق. - للحصول على حجم أكبر، قسّم الخلايا إلى عدة أنابيب اختبار ذات قاع مستدير 12 × 75 مم أو انقلها إلى أنبوب اختبار ذي قاع مستدير 17 × 100 مم، بحيث لا يتجاوز الحجم المضاف 3.0 مل. ضع هذا الأنبوب على مغناطيس فصل الخلايا (في الوضع الرأسي) لمدة 8 دقائق. 10. مع بقاء الأنبوب على مغناطيس فصل الخلايا، وباستخدام ماصة باستور زجاجية معقمة، اسحب السائل الطافي (الجزء المُخصب) بعناية وضعه في أنبوب معقم جديد. 11. أخرج أنبوب الجزء الموجب من مغناطيس فصل الخلايا، وأضف محلول BD IMag™ بتركيز 1X بنفس الحجم كما في الخطوة 8. أعد تعليق الجزء الموجب جيدًا عن طريق السحب والدفع بالماصة من 10 إلى 15 مرة (مع تجنب تكوّن الفقاعات)، ثم أعد الأنبوب إلى مغناطيس فصل الخلايا لمدة 6 إلى 8 دقائق. - بالنسبة للأنبوب 17 × 100 مم: ضعه على مغناطيس فصل الخلايا لمدة 8 دقائق. 12. باستخدام ماصة باستور معقمة جديدة، اسحب السائل الطافي بعناية واخلطه مع الجزء المُخصب من الخطوة 10 أعلاه. ١٣. كرر الخطوتين ١١ و١٢. يحتوي الجزء المُخصب المُجمع على خلايا غير مُنتمية لا ترتبط بها أجسام مضادة أو جزيئات مغناطيسية. ١٤. لزيادة نقاء الجزء المُخصب المُجمع، ضع الأنبوب الذي يحتوي عليه على مغناطيس فصل الخلايا لمدة ٣-١٠ دقائق إضافية. زيادة مدة المغناطيس ستزيد النقاء ولكنها ستُقلل الاستخلاص. - بالنسبة لأنبوب ١٧ × ١٠٠ مم: ضعه على مغناطيس فصل الخلايا لمدة ٦-١٠ دقائق. ١٥. اسحب السائل الطافي بعناية وضعه في أنبوب معقم جديد. هذا هو الجزء غير المُنتمى المُخصب مرتين. الخلايا جاهزة للمعالجة في التطبيقات اللاحقة. ١٦. يمكن إعادة تعليق خلايا الجزء الموجب المتبقية في الأنبوب الأصلي في محلول منظم مناسب أو وسط زراعة للتطبيقات اللاحقة، بما في ذلك قياس التدفق الخلوي، إذا رغبت في ذلك. ١٧. يجب تحليل عينات من معلق الخلايا الكلي، والجزء الموجب، والجزء المُخصب بواسطة قياس التدفق الخلوي لتقييم كفاءة إجراء فصل الخلايا. ملاحظات: * نصائح لتحضير الخلايا بنجاح: - اسحب الدم في أنبوب يحتوي على EDTA. - افصل البلازما الغنية بالصفائح الدموية عن طريق الطرد المركزي مرة واحدة بسرعة 220-240 × g. - اغسل الخلايا 2-3 مرات بمحلول PBS بعد فصلها باستخدام تدرج الكثافة. - بعد الغسلة الأخيرة، أعد تعليق الخلايا بتركيز عالٍ نسبيًا في محلول BD IMag™ 1X، ثم انتقل إلى الخطوة 3. † تجنب التلوين غير المحدد بالعمل بسرعة والالتزام بأوقات الحضانة الموصى بها.
إشعارات المنتج: مصدر جميع بروتينات المصل هو مسالخ معتمدة من وزارة الزراعة الأمريكية، وتقع في الولايات المتحدة. تحذير: ينتج أزيد الصوديوم حمض الهيدرازويك شديد السمية في الظروف الحمضية. خفف مركبات الأزيد بالماء الجاري قبل التخلص منها لتجنب تراكم رواسب قابلة للانفجار في أنابيب الصرف الصحي. تُحضّر جزيئات BD IMag™ من جزيئات مغناطيسية مُعدّلة بمجموعات الكربوكسيل، تُصنّعها شركة Skold Technology، وهي مرخصة بموجب براءة الاختراع الأمريكية رقم 7,169,618. Ficoll-Paque هي علامة تجارية مسجلة لشركة Amersham Biosciences Limited. يُرجى مراجعة www.bdbiosciences.com/us/s/resources للاطلاع على البروتوكولات الفنية.
الوصف: معرف EntrezGene
غير متاح : غير متاح