BD، 552944، BD™ DimerX DimerX I: بروتين اندماجي ثنائي قابل للذوبان من الفأر H-2Kb:Ig

التحضير والتخزين: يُحفظ المنتج غير مخففًا في درجة حرارة 4 درجات مئوية، ويُحفظ بعيدًا عن الضوء لفترات طويلة. لا يُجمد. تم التعبير عن البروتين الثنائي H-2Kb:Ig مع بروتين β2M البشري في سلالة خلايا ورم البلازما الفأري J558L (ATCC TIB-6). ترتبط سلاسل عديد الببتيد H-2Kb وβ2M بروابط غير تساهمية نتيجةً للتعبير المشترك عنهما داخل خلايا J558L. تم تنقية البروتين المدمج H-2Kb:Ig من سائل مزرعة الأنسجة باستخدام كروماتوغرافيا التقارب. تم ربط البروتين بـ R-PE في ظل الظروف المثلى، وتمت إزالة البروتين غير المرتبط وPE الحر.
إجراءات الفحص الموصى بها: تم اختبار بروتين الاندماج H-2Kb:Ig هذا باستخدام التلوين المناعي الفلوري (≤ 4 ميكروغرام H-2Kb:Ig/مليون خلية) وتحليل التدفق الخلوي للخلايا التائية النوعية للمستضد لضمان النوعية والتفاعل. من الضروري تحميل أجزاء H-2Kb من البروتين الثنائي بببتيد ذي صلة قبل التلوين المناعي الفلوري للخلايا التائية. يتم تحميل معقدات H-2Kb:Ig بكفاءة عن طريق الحضانة مع فائض من الببتيدات ذات الصلة (النوعية) أو غير ذات الصلة (الضابطة) (انظر البروتوكول 1). يمكن استخدام H-2Kb:Ig المحمل بالببتيد للتلوين المناعي الفلوري (انظر البروتوكول 2). نظرًا لاختلاف التطبيقات، يجب على كل باحث تحديد التخفيفات المناسبة للاستخدام الفردي. البروتوكول 1: تحميل الببتيد على البروتين الثنائي H-2Kb:Ig. يُعد مستنسخ الخلايا التائية 2C، وهو مستنسخ متفاعل مع المستضدات الغريبة، متخصصًا في ببتيد داخلي المنشأ يُدعى p2Ca. وقد تم تحديد العديد من الببتيدات ذات الصلة أو نظائرها. تختلف هذه الببتيدات في تقييدها بواسطة معقد التوافق النسيجي الرئيسي (MHC) وفي ألفة ارتباطها بمستقبلات الخلايا التائية 2C (TCR). بالنسبة لـ H-2Kb، يمكن أيضًا التعرف على ببتيد SIY بواسطة مستقبلات الخلايا التائية 2C في سياق H-2Kb. يتمتع SIY بألفة عالية نسبيًا لـ H-2Kb، ويُقترح استخدامه كعنصر تحكم إيجابي لتلوين خلايا 2C في هذا الاختبار. تم اشتقاق مستنسخ 2C في الأصل عن طريق تحفيز خلايا طحال فئران BALB/c بخلايا P815 (H-2Ld) المُشععة. وقد وُصفت العديد من بروتوكولات تحميل الببتيد. تعتمد الطريقة المستخدمة في شركة BD Biosciences Pharmingen على التحميل السلبي للببتيد الزائد في المحلول مع بروتين H-2Kb:Ig. وقد وجدنا أن التحميل السلبي فعالٌ للغاية، خاصةً مع الببتيدات ذات الألفة العالية. أما بالنسبة للببتيدات ذات الألفة المنخفضة، فقد يؤدي رفع النسبة المولية للببتيد إلى H-2Kb:Ig إلى تحسين التحميل، كما تم تحديده بواسطة تحليل التدفق الخلوي. يُقترح أن يقوم الباحث، لكل ببتيد، بتحديد معايير مثل جرعة H-2Kb:Ig لكل مليون خلية، والنسبة المولية للببتيد إلى H-2Kb:Ig، ووقت تحميل الببتيد تجريبيًا. على الرغم من أن منتج DimerX هذا يحتوي على β2 ميكروغلوبولين، فإننا نوصي الباحثين الذين يحتاجون إلى كمية زائدة من β2 ميكروغلوبولين البشري المؤتلف، باستخدام منتج BD Biosciences رقم 551089. تحضير الببتيد وتحميله: 1. يجب تحديد الوزن الجزيئي (MW) للببتيد المطلوب. يمكن تقدير الوزن الجزيئي للببتيد بضرب عدد الأحماض الأمينية (n) فيه في 130 دالتون (d) لكل حمض أميني: الوزن الجزيئي للببتيد (d) = n (عدد الأحماض الأمينية) × 130 (d/عدد الأحماض الأمينية). 2. يمكن تحضير محلول أساسي من الببتيد بتركيز 20 ملغم/مل في ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO). يُخفف محلول الببتيد إلى تركيز 2 ملغم/مل في محلول DPBS معقم، بدرجة حموضة 7.2، لاستخدامه في بروتوكول تحميل H-2Kb:Ig. 3. يُخلط بروتين H-2Kb:Ig مع ببتيد محدد أو ببتيد تحكم بزيادة مولية قدرها 40 أو 160 أو 640 مولار. يمكن استخدام الحساب التالي، باستخدام ببتيد مكون من 8 أحماض أمينية (8mer) كمثال: Dp = الوزن الجزيئي للببتيد: على سبيل المثال، 8 أحماض أمينية × 130 = 1040 دالتون. DKb = الوزن الجزيئي لـ H-2Kb:Ig = 250,000 دالتون. R = النسبة المولية الزائدة المطلوبة، على سبيل المثال، 160. Mp = ميكروغرام (ميكروغرام) من الببتيد المطلوب. MKb = ميكروغرام (ميكروغرام) من H-2Kb:Ig في التفاعل. الكمية النموذجية من H-2Kb:Ig المحمل بالببتيد والمستخدمة في تلوين قياس التدفق الخلوي هي من 0.25 إلى 4 ميكروغرام/مليون خلية (للاختبار). Mp = MKb × R × Dp = 4 ميكروغرام × 160 × 1040 دالتون = 2.66 ميكروغرام DKb / 250,000 دالتون. لذلك، يُضاف 2.66 ميكروغرام من الببتيد و4 ميكروغرام من H-2Kb:Ig إلى المحلول للحصول على التحميل الأمثل للببتيد على H-2Kb:Ig. ٤. امزج الببتيد وH-2Kb:Ig معًا في محلول فوسفات ملحي (PBS) بدرجة حموضة ٧.٢، ثم حضّن المزيج عند درجة حرارة ٣٧ درجة مئوية طوال الليل. يمكن تخزين H-2Kb:Ig المحمّل بالببتيد عند درجة حرارة ٤ درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوع واحد. البروتوكول ٢: بروتوكول التلوين المناعي الفلوري ١. أعد تعليق خلايا الفأر في محلول تلوين FACS [مثل DPBS، ١٪ FCS، ٠.٠٩٪ NaN3 أو محلول تلوين BD Pharmingen™ (FBS)، رقم المنتج ٥٥٤٦٥٦]، والذي يحتوي على الكمية المناسبة من الجسم المضاد أحادي النسيلة BD Fc Block™ المضاد للفأر CD16/CD32 2.4G2 (رقم المنتج ٥٥٣١٤١/٥٥٣١٤٢)، بتركيز يقارب ١٠ × ١٠⁶ خلية لكل ٥٠ ميكرولتر. حضّن المزيج لمدة ١٠ دقائق عند درجة حرارة ٤ درجات مئوية. أضف حوالي 1 × 10⁶ خلية لكل أنبوب تلوين (مثلاً، أنبوب 12 × 75 مم، BD Falcon™ رقم المنتج 352008). 2. أضف من 0.25 إلى 4 ميكروغرام من بروتين H-2Kb:Ig المحمل بالببتيد إلى معلق الخلايا. يمكن أيضاً إضافة أي أجسام مضادة خاصة بعلامات سطح الخلية إلى معلق الخلايا خلال هذه الخطوة. حضّن لمدة 60 دقيقة عند 4 درجات مئوية. 3. اغسل الخلايا مرتين باستخدام 2 مل من محلول FACS، ثم قم بالطرد المركزي لمدة 5 دقائق عند 250 × g، وتخلص من السائل الطافي. أعد تعليق الخلايا المترسبة في حوالي 0.5 مل من محلول التلوين في أنبوب مناسب لجهاز قياس التدفق الخلوي.
ملاحظات المنتج: نظرًا لاختلاف التطبيقات، ينبغي على كل باحث معايرة الكاشف للحصول على أفضل النتائج. يُرجى مراجعة www.bdbiosciences.com/us/s/resources للاطلاع على البروتوكولات الفنية. للاطلاع على أطياف الفلوركروم وإعدادات الجهاز المناسبة، يُرجى مراجعة صفحة قياس التدفق الخلوي متعدد الألوان على موقعنا الإلكتروني www.bdbiosciences.com/colors. تحذير: ينتج أزيد الصوديوم حمض الهيدرازويك شديد السمية في الظروف الحمضية. خفف مركبات الأزيد بالماء الجاري قبل التخلص منها لتجنب تراكم رواسب قابلة للانفجار في أنابيب الصرف الصحي.