BD، 556570، مجموعة الكشف عن موت الخلايا المبرمج BD Pharmingen™ FITC Annexin V II

التطبيق: قياس التدفق الخلوي (يتم اختباره بشكل روتيني)
الوضع التنظيمي: للاستخدام البحثي فقط
RRID: AB_2869085
الوصف: الاستماتة عملية فسيولوجية طبيعية تحدث أثناء التطور الجنيني، وكذلك في الحفاظ على استتباب الأنسجة. يتميز برنامج الاستماتة ببعض السمات المورفولوجية، بما في ذلك فقدان تناظر غشاء البلازما وارتباطه، وتكثف السيتوبلازم والنواة، وانقسام الحمض النووي بين النيوكليوسومات. يُعد فقدان غشاء البلازما من أوائل السمات. في الخلايا المستميتة، ينتقل فوسفوليبيد الفوسفاتيديل سيرين (PS) من الطبقة الداخلية إلى الطبقة الخارجية لغشاء البلازما، مما يعرضه للبيئة الخلوية الخارجية. أنيكسين V هو بروتين رابط للفوسفوليبيدات يعتمد على الكالسيوم (Ca2+) بوزن جزيئي يتراوح بين 35 و36 كيلو دالتون، وله ألفة عالية لـ PS، ويرتبط بالخلايا التي يكون فيها PS مكشوفًا. يمكن ربط أنيكسين V بصبغات فلورية، بما في ذلك FITC. يحتفظ هذا الشكل بألفة عالية للفوسفاتيديل سيرين (PS)، مما يجعله أداة حساسة لتحليل الخلايا التي تخضع للاستماتة باستخدام قياس التدفق الخلوي. ونظرًا لأن ظهور الفوسفاتيديل سيرين على السطح الخارجي للغشاء الخلوي يحدث في المراحل المبكرة من الاستماتة، فإن تلوين FITC Annexin V يُمكن من تحديد الاستماتة في مرحلة أبكر من الفحوصات القائمة على التغيرات النووية مثل تفتت الحمض النووي. يسبق تلوين FITC Annexin V فقدان سلامة الغشاء الخلوي الذي يصاحب المراحل الأخيرة من موت الخلايا الناتج عن الاستماتة أو النخر. لذلك، يُستخدم تلوين FITC Annexin V عادةً بالتزامن مع صبغة حيوية مثل بروبيديوم يوديد (PI) أو 7-أمينو-أكتينوميسين (7-AAD) لتمكين الباحث من تحديد الخلايا في المراحل المبكرة من الاستماتة (سلبية لـ PI، إيجابية لـ FITC Annexin V). الخلايا الحية ذات الأغشية السليمة لا تسمح بمرور PI، بينما تكون أغشية الخلايا الميتة والتالفة نفاذة لـ PI. على سبيل المثال، تُعتبر الخلايا حية إذا كانت سلبية لكل من FITC Annexin V و PI. الخلايا التي تمر بمرحلة مبكرة من الاستماتة تكون موجبة لصبغة FITC Annexin V وسالبة لصبغة PI؛ أما الخلايا التي تمر بمرحلة متأخرة من الاستماتة أو الميتة بالفعل فتكون موجبة لكلتا الصبغتين. لا يميز هذا الاختبار بين الخلايا التي خضعت للاستماتة وتلك التي ماتت نتيجة مسار نخر، لأنه في كلتا الحالتين، ستتصبغ الخلايا الميتة بكلتا الصبغتين Annexin-FITC و PI. مع ذلك، عند قياس الاستماتة بمرور الوقت، يمكن تتبع الخلايا غالبًا من خلايا سالبة لصبغتي FITC Annexin V و PI (خلايا حية، أو لا يوجد استماتة قابلة للقياس)، إلى خلايا موجبة لصبغة FITC Annexin V وسالبة لصبغة PI (استماتة مبكرة، مع سلامة الغشاء الخلوي)، وأخيرًا إلى خلايا موجبة لصبغتي FITC Annexin V و PI (استماتة نهائية وموت). يشير انتقال الخلايا عبر هذه المراحل الثلاث إلى حدوث الاستماتة. في المقابل، فإن ملاحظة واحدة تشير إلى أن الخلايا إيجابية لكل من FITC Annexin V و PI، في حد ذاتها، تكشف معلومات أقل عن العملية التي مرت بها الخلايا بزوالها.
التحضير والتخزين: يُحفظ المنتج غير المخفف في درجة حرارة 4 درجات مئوية، بعيدًا عن الضوء لفترات طويلة. لا يُجمد. تُحفظ جميع المكونات باستثناء بروتين أنيكسين V المُعاد تركيبه (رقم المكون 51-65871A) في درجة حرارة 4 درجات مئوية، بعيدًا عن الضوء لفترات طويلة. لا يُجمد. يُحفظ بروتين أنيكسين V المُعاد تركيبه (رقم المكون 51-65871A) في درجة حرارة -80 درجة مئوية، مع تجنب دورات التجميد والذوبان المتكررة لتقليل خطر تلف البروتين.
إجراءات التحليل الموصى بها: يُعدّ FITC Annexin V مسبارًا حساسًا لتحديد الخلايا الميتة، حيث يرتبط بأسطح الفوسفوليبيدات سالبة الشحنة (Kd ~5 × 10^-2) بألفة أعلى للفوسفاتيديل سيرين (PS) مقارنةً بمعظم الفوسفوليبيدات الأخرى. يعتمد ارتباط FITC Annexin V على الكالسيوم، لذا يلزم تحديد تركيزات معينة من الكالسيوم والأملاح للحصول على تلوين مثالي، كما هو موضح في بروتوكول تلوين FITC Annexin V. ينبغي على الباحثين ملاحظة أن تحليل التدفق الخلوي باستخدام FITC Annexin V على أنواع الخلايا الملتصقة (مثل HeLa وNIH 3T3 وغيرها) لا يُجرى بشكل روتيني، نظرًا لاحتمالية حدوث تلف محدد في الغشاء أثناء فصل الخلايا أو جمعها. مع ذلك، فقد نُشرت سابقًا طرق لاستخدام Annexin V في قياس التدفق الخلوي على أنواع الخلايا الملتصقة (Casiola-Rosen et al. وvan Engelend et al.). تحفيز موت الخلايا المبرمج بواسطة كامبتوثيسين: يُقدَّم البروتوكول التالي كمثال توضيحي لكيفية استخدام FITC Annexin V على خط خلوي (Jurkat). المواد: 1. تحضير محلول كامبتوثيسين المركز (Sigma-Aldrich Cat. No. C-9911): 1 ملي مولار في DMSO. 2. خلايا Jurkat T (ATCC TIB-152). الإجراء: 1. إضافة كامبتوثيسين (التركيز النهائي 4-6 ميكرومولار) إلى 1 × 10^6 خلية Jurkat. 2. حضانة الخلايا لمدة 4-6 ساعات عند 37 درجة مئوية. 3. اتباع بروتوكول تلوين FITC Annexin V لقياس موت الخلايا المبرمج. بروتوكول تلوين وحجب FITC Annexin V: يُستخدم FITC Annexin V لتحديد النسبة المئوية للخلايا التي تخضع لموت الخلايا المبرمج بشكل كمي ضمن مجموعة من الخلايا. تعتمد هذه الطريقة على خاصية فقدان الخلايا لتناظر أغشيتها في المراحل المبكرة من الاستماتة الخلوية. في الخلايا المستميتة، ينتقل الفوسفوليبيد الغشائي فوسفاتيديل سيرين (PS) من الطبقة الداخلية للغشاء البلازمي إلى الطبقة الخارجية، مما يعرضه للبيئة الخارجية. يُعدّ أنيكسين V بروتينًا رابطًا للفوسفوليبيدات يعتمد على الكالسيوم، وله ألفة عالية لـ PS، وهو مفيد في تحديد الخلايا المستميتة التي تعرض PS. يُستخدم بروبيديوم يوديد (PI) ككاشف قياسي لقياس حيوية الخلايا باستخدام قياس التدفق الخلوي، وذلك للتمييز بين الخلايا الحية وغير الحية. تمنع الخلايا الحية ذات الأغشية السليمة مرور PI، بينما تكون أغشية الخلايا الميتة والتالفة نفاذة له. الخلايا التي تُظهر تلوينًا إيجابيًا لأنيكسين V المرتبط بـ FITC وتلوينًا سلبيًا لـ PI تكون في طور الاستماتة الخلوية. أما الخلايا التي تُظهر تلوينًا إيجابيًا لكل من أنيكسين V المرتبط بـ FITC و PI، فتكون إما في المرحلة النهائية من الاستماتة الخلوية، أو في طور النخر، أو ميتة بالفعل. الخلايا التي لا تظهر أي تلوين إيجابي لكل من FITC Annexin V و PI هي خلايا حية ولا تخضع لعملية موت خلوي مبرمج قابلة للقياس. المواد الكيميائية: 1. FITC Annexin V (رقم المكون 51-65874X): استخدم 5 ميكرولتر لكل اختبار. 2. بروبيديوم يوديد (PI) (رقم المكون 51-66211E) صبغة حمض نووي سهلة الاستخدام وجاهزة للاستخدام. استخدم 5 ميكرولتر لكل اختبار. 3. محلول ربط Annexin V بتركيز 10X (رقم المكون 51-66121E): 0.1 مولار هيبس/هيدروكسيد الصوديوم (الأس الهيدروجيني 7.4)، 1.4 مولار كلوريد الصوديوم، 25 ملي مولار كلوريد الكالسيوم. لتحضير محلول عمل بتركيز 1X، خفف جزءًا واحدًا من محلول ربط Annexin V بتركيز 10X إلى 9 أجزاء من الماء المقطر. ٤. أنيكسين V المؤتلف النقي (رقم المكون ٥١-٦٥٨٧١A): استخدم ٥-١٥ ميكروغرام لكل اختبار. يُنصح الباحثون بمعايرة الكاشف للحصول على أفضل النتائج. التلوين: ١. اغسل الخلايا مرتين بمحلول فوسفات بارد، ثم أعد تعليقها في محلول ربط بتركيز ١× (١ × ١٠^٦ خلية/مل). ٢. انقل ١٠٠ ميكرولتر من المحلول (١ × ١٠^٥ خلية) إلى أنبوب زراعة سعة ٥ مل. ٣. أضف ٥ ميكرولتر من أنيكسين V الموسوم بـ FITC و٥ ميكرولتر من PI. ٤. رجّ الخلايا برفق باستخدام جهاز الخلط الدوامي، ثم حضّنها لمدة ١٥ دقيقة في درجة حرارة الغرفة (٢٥ درجة مئوية) في الظلام. ٥. أضف ٤٠٠ ميكرولتر من محلول الربط بتركيز ١× (١×) إلى كل أنبوب. حلل باستخدام قياس التدفق الخلوي خلال ساعة واحدة. كإجراء تحكم اختياري، يمكن للباحثين تحضين عينات الخلايا مسبقًا مع بروتين Annexin V المؤتلف النقي (رقم المكون 51-65871A). من خلال حجب مواقع ارتباط FITC Annexin V، يمكن إثبات الارتباط النوعي لـ FITC Annexin V كما هو موضح في الشكل. 1. اغسل الخلايا مرتين بمحلول PBS بارد، ثم أعد تعليقها في محلول ربط 1X بتركيز 1 × 10^6 خلية/مل. 2. انقل 100 ميكرولتر من المحلول (1 × 10^5 خلية) إلى أنبوب زراعة سعة 5 مل. 3. أضف 5-15 ميكروغرام من بروتين Annexin V المؤتلف النقي. قد تختلف كمية بروتين Annexin V المؤتلف النقي اللازمة لتشبع مواقع الارتباط باختلاف نوع الخلية ومرحلة الاستماتة الخلوية. في بعض الحالات، قد يحتاج الباحثون إلى تقليل عدد الخلايا إلى 0.5 × 10⁵ مع إضافة 5-15 ميكروغرام من Annexin V المؤتلف للحصول على أفضل النتائج. يُنصح بشدة بإجراء المعايرة. 4. رجّ الخلايا برفق باستخدام جهاز الخلط الدوامي، ثم حضّنها لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. 5. أضف 5 ميكرولتر من FITC Annexin V و5 ميكرولتر من PI. 6. رجّ الخلايا برفق باستخدام جهاز الخلط الدوامي، ثم حضّنها لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام. 7. أضف 400 ميكرولتر من محلول الربط 1X إلى كل أنبوب. حلل باستخدام قياس التدفق الخلوي في أسرع وقت ممكن (خلال ساعة واحدة). الضوابط المقترحة لإعداد قياس التدفق الخلوي: تُستخدم الضوابط التالية لضبط التعويض والأرباع: 1. خلايا غير مصبوغة. 2. خلايا مصبوغة بـ FITC Annexin V (بدون PI). 3. خلايا مصبوغة بـ PI (بدون FITC Annexin V). ضوابط التلوين الأخرى: يجب استخدام سلالة خلوية يسهل تحفيزها على الخضوع للاستماتة للحصول على تلوين تحكم إيجابي باستخدام FITC Annexin V و/أو FITC Annexin V و PI. من المهم ملاحظة أن المستوى الأساسي للاستماتة والنخر يختلف اختلافًا كبيرًا داخل المجموعة الخلوية. وبالتالي، حتى في غياب الاستماتة المحفزة، ستحتوي معظم مجموعات الخلايا على نسبة ضئيلة من الخلايا التي تُظهر استماتة (FITC Annexin V إيجابي، PI سلبي أو FITC Annexin V إيجابي، PI إيجابي). تُستخدم المجموعة غير المعالجة لتحديد المستوى الأساسي للخلايا الميتة والمستميتة. ثم تُحدد نسبة الخلايا التي تم تحفيزها على الخضوع للاستماتة عن طريق طرح نسبة الخلايا المستميتة في المجموعة غير المعالجة من نسبة الخلايا المستميتة في المجموعة المعالجة. بما أن موت الخلايا هو النتيجة النهائية للخلايا التي تخضع للاستماتة، فإن الخلايا في المراحل المتأخرة من الاستماتة سيكون لها غشاء تالف وستتصبغ بشكل إيجابي لكل من PI وFITC Annexin V. وبالتالي، فإن الفحص لا يميز بين الخلايا التي خضعت بالفعل لموت الخلايا المبرمج وتلك التي ماتت نتيجة لمسار النخر، لأنه في كلتا الحالتين ستتصبغ الخلايا الميتة بكل من FITC Annexin V وPI.
ملاحظات المنتج: نظرًا لاختلاف التطبيقات، ينبغي على كل باحث معايرة الكاشف للحصول على أفضل النتائج. مصدر جميع بروتينات المصل هو مسالخ معتمدة من وزارة الزراعة الأمريكية، وتقع في الولايات المتحدة. تحذير: ينتج أزيد الصوديوم حمض الهيدرازويك شديد السمية في الظروف الحمضية. خفف مركبات الأزيد بالماء الجاري قبل التخلص منها لتجنب تراكم رواسب قابلة للانفجار في أنابيب الصرف الصحي. يرجى مراجعة www.bdbiosciences.com/us/s/resources للاطلاع على البروتوكولات الفنية.
الوصف: الكمية/الحجم: رقم القطعة: معرف EntrezGene
غير متوفر : 50.0 : غير متوفر : غير متوفر