BD، 558710، BD Pharmingen™ Alexa Fluor® 647 Mouse anti-Cleaved PARP (Asp 214)

الاسم البديل: Asp214
التفاعل: بشري (اختبار مراقبة الجودة)، فأر (تم اختباره أثناء التطوير)
النمط المصلي: IgG1 الفأري، κ
المستضد: PARP البشري المشقوق
التطبيقات: التلوين داخل الخلايا (قياس التدفق الخلوي) (يتم اختباره بشكل روتيني)، التصوير الحيوي، التألق المناعي (يتم اختباره أثناء التطوير)
حجم العينة لكل اختبار: 5 ميكرولتر
RRID: AB_1645431
محلول التخزين: محلول مائي منظم يحتوي على BSA ومثبت البروتين و ≤0.09% أزيد الصوديوم.
الوضع التنظيمي: للاستخدام البحثي فقط
التحضير والتخزين: يُحفظ غير مخفف في درجة حرارة 4 درجات مئوية، ويُحفظ بعيدًا عن الضوء لفترات طويلة. لا يُجمد. تم تنقية الجسم المضاد أحادي النسيلة من سائل مزرعة الأنسجة أو السائل الاستسقائي باستخدام كروماتوغرافيا التقارب. تم ربط الجسم المضاد بصبغة أليكسا فلور® 647 في ظل الظروف المثلى، وتمت إزالة صبغة أليكسا فلور® 647 غير المتفاعلة.
إجراءات الفحص الموصى بها: إجراءات الفحص الموصى بها للتصوير الحيوي • الستوروسبورين (من بكتيريا Streptomyces staurosporeus) هو مثبط غير انتقائي نسبيًا لكيناز البروتين، ويُستخدم غالبًا كعامل عام لتحفيز موت الخلايا المبرمج. يجب تحضير محلول أساسي من الستوروسبورين بتركيز 2 ميكرومولار في وسط الاستنبات قبل الاستخدام. • يصبغ هذا الجسم المضاد خلايا HeLa (ATCC CCL-2) وA549 (ATCC CCL-185) وU-2 OS (ATCC HTB-96)، ويعمل إما مع الميثانول البارد بنسبة 90% أو مع محلول BD Perm/Wash™ للنفاذية. 1. ازرع الخلايا في وسط الاستنبات المناسب بمعدل 10000 خلية تقريبًا لكل بئر في صفيحة BD Falcon™ للتصوير ذات 96 بئرًا (رقم المنتج 353219)، واتركها في الاستنبات طوال الليل. ٢. أضف التراكيز المناسبة من الستوروسبورين، المخفف في ١٠٠ ميكرولتر من وسط الاستنبات، إلى الآبار، ثم ازرعها لمدة ٤ ساعات. ٣. ثبّت الخلايا بإضافة ١٠٠ ميكرولتر من محلول فورمالدهيد ١٢٪ مُسخّن مسبقًا (٣٧ درجة مئوية) إلى كل بئر، ثم حضّنها لمدة ٣٠ دقيقة في درجة حرارة الغرفة. الحجم النهائي ٣٠٠ ميكرولتر لكل بئر بتركيز نهائي للفورمالدهيد ٤٪. ٤. أزل المُثبّت من الآبار، واغسل الخلايا مرتين بمحلول فوسفات ملحي (PBS) بتركيز ١×. ٥. اجعل الخلايا نفاذة باستخدام إما ميثانول بارد ٩٠٪ عند درجة حرارة -٢٠ درجة مئوية (مثل BD Phosflow™ Perm Buffer III، رقم المنتج ٥٥٨٠٥٠) أو محلول BD Perm/Wash™ (رقم المنتج ٥٥٤٧٢٣): أ. أضف 100 ميكرولتر من ميثانول 90% عند درجة حرارة -20 درجة مئوية، ومحلول BD Phosflow™ Perm Buffer III (رقم المنتج 558050)، إلى كل بئر، ثم حضّن لمدة 5 دقائق. أو ب. أضف 100 ميكرولتر من محلول BD Perm/Wash™ المخفف (1×) إلى كل بئر، ثم حضّن لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. 6. أزل عامل النفاذية، واغسل الآبار مرتين باستخدام 100 ميكرولتر من محلول PBS المخفف (1×). 7. خفف مُقترن الأجسام المضادة Alexa Fluor® 647 Mouse anti-Cleaved PARP (Asp 214): أ. إذا تم نفاذ الخلايا باستخدام الميثانول البارد، فخفف الجسم المضاد بنسبة 1:10 في محلول PBS المخفف (1×)، أو ب. إذا تم نفاذ الخلايا باستخدام محلول BD Perm/Wash™، فقم بتخفيف الجسم المضاد بنسبة 1:10 في محلول BD Perm/Wash™ بتركيز 1×. 8. قم بتلوين الخلايا بإضافة 50 ميكرولتر من الجسم المضاد المخفف إلى كل بئر، ثم حضّنها لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة أو طوال الليل عند 4 درجات مئوية، مع حمايتها من الضوء. 9. أزل الجسم المضاد المخفف، واغسل الآبار مرتين باستخدام 100 ميكرولتر من محلول PBS بتركيز 1×. ثم أزل محلول PBS. 10. لتلوين النوى بشكل معاكس، قم بتخفيف محلول Hoechst 33342 (رقم المنتج 561908) إلى تركيز 2 ميكروغرام/مل في محلول PBS بتركيز 1×، وأضف 200 ميكرولتر إلى كل بئر قبل التصوير بـ 15 دقيقة على الأقل. 11. اعرض الخلايا وحللها باستخدام جهاز تصوير مناسب. المرشحات الموصى بها لأجهزة BD Pathway™ هي: مرشح الإثارة، مرشح الانبعاث، مرشح ثنائي اللون BD Pathway 855 620/60 700/75 660 LP، مرشح BD Pathway 435 628/40 690/40 FF660. لأجهزة قياس التدفق الخلوي: • تم الإبلاغ عن أن الكامبتوثيسين، وهو مستخلص من شجرة الكامبتوثيكا أكيوميناتا الصينية، يحفز موت الخلايا المبرمج بطريقة تعتمد على الجرعة في المختبر. يجب تحضير محلول أساسي من الكامبتوثيسين بتركيز 1.0 ملي مولار (مثلًا، سيجما-ألدريتش؛ رقم المنتج C-9911) في ثنائي ميثيل سلفوكسيد قبل الاستخدام. 1. أضف الكامبتوثيسين بتركيز نهائي يتراوح بين 4 و6 ميكرومولار لكل 1 × 10^6 خلية جركات متكاثرة (سرطان الدم الليمفاوي التائي البشري؛ ATCC TIB-152). يجب أيضًا تحضير عينة تحكم من الخلايا غير المعالجة. 1. حضّن الخلايا لمدة تتراوح بين 4 و18 ساعة في حاضنة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية. 2. اغسل الخلايا مرتين بمحلول فوسفات بارد، ثم أعد تعليقها في محلول BD Cytofix/Cytoperm™ بتركيز 2 × 10^6 خلية/مل، وحضّنها لمدة 20 دقيقة على الجليد. 3. افصل الخلايا بالترسيب، ثم اسحب محلول BD Cytofix/Cytoperm™ وتخلص منه. 4. اغسل الخلايا مرتين في درجة حرارة الغرفة باستخدام 0.5 مل من محلول BD Perm/Wash™ لكل 1 × 10^6 خلية، وتخلص من السائل الطافي. 5. أعد تعليق الخلايا في محلول BD Perm/Wash™ بتركيز 10 × 10^6 خلية/مل، وقسّم عينات الاختبار إلى أجزاء متساوية بحجم 1 × 10^6 خلية لكل 100 ميكرولتر. ٦. أضف ٥ ميكرولتر من الأجسام المضادة Alexa Fluor® 647 Mouse Anti-Cleaved PARP (Asp 214) لكل اختبار، واحضنها لمدة ٣٠ دقيقة في درجة حرارة الغرفة، مع حمايتها من الضوء. ٧. اغسل كل اختبار في ١.٠ مل من محلول BD Perm/Wash™ وتخلص من السائل الطافي. ٨. أعد تعليق كل اختبار في ٠.٥ مل من محلول BD Perm/Wash™ وحلله باستخدام قياس التدفق الخلوي.
إشعارات المنتج: تم تطوير هذا الجسم المضاد واعتماده لتطبيقات التصوير الحيوي. مع ذلك، لا يُجرى اختبار التصوير الحيوي الروتيني على كل دفعة. يُنصح الباحثون بمعايرة الكاشف للحصول على أفضل أداء. تم تخفيف هذا الكاشف مسبقًا للاستخدام بالحجم الموصى به لكل اختبار. نستخدم عادةً 1 × 10^6 خلية في عينة تجريبية بحجم 100 ميكرولتر (اختبار). يتم جمع انبعاث صبغة Alexa Fluor® 647 الفلورية بنفس إعدادات الجهاز المستخدمة مع الألوفيوكوسيانين (APC). للاطلاع على أطياف الصبغات الفلورية وإعدادات الجهاز المناسبة، يُرجى زيارة صفحة قياس التدفق الخلوي متعدد الألوان على موقعنا الإلكتروني www.bdbiosciences.com/colors. تُباع مُقترنات الأجسام المضادة المصبوغة بصبغات Alexa Fluor® و Pacific Blue™ و Cascade Blue® في هذا المنتج بموجب ترخيص من شركة Molecular Probes, Inc. للاستخدام البحثي فقط، باستثناء استخدامها مع المصفوفات الدقيقة، أو ككواشف خاصة بالمادة المُحللة. تخضع أصباغ Alexa Fluor® (باستثناء Alexa Fluor® 430)، وصبغة Pacific Blue™، وصبغة Cascade Blue® لبراءات اختراع قيد الانتظار وصادرة. تنبيه: ينتج أزيد الصوديوم حمض الهيدرازويك شديد السمية في الظروف الحمضية. لذا، يُرجى تخفيف مركبات الأزيد بالماء الجاري قبل التخلص منها لتجنب تراكم رواسب قابلة للانفجار في أنابيب الصرف الصحي. مصدر جميع بروتينات المصل هو مسالخ معتمدة من وزارة الزراعة الأمريكية، وتقع في الولايات المتحدة. Alexa Fluor® علامة تجارية مسجلة لشركة Molecular Probes, Inc.، يوجين، أوريغون. يُرجى مراجعة الموقع الإلكتروني www.bdbiosciences.com/us/s/resources للاطلاع على البروتوكولات الفنية.