BD، 560506، BD Horizon™ V450 Annexin V

النمط المتماثل: لا شيء لا شيء
التطبيق: قياس التدفق الخلوي (يتم اختباره بشكل روتيني)
حجم العينة لكل اختبار: 5 ميكرولتر
RRID: AB_2869356
محلول التخزين: محلول مائي منظم يحتوي على BSA ومثبت البروتين و ≤0.09% أزيد الصوديوم.
الوضع التنظيمي: للاستخدام البحثي فقط
التحضير والتخزين: يُحفظ غير مخفف في درجة حرارة 4 درجات مئوية، ويُحفظ بعيدًا عن الضوء لفترات طويلة. لا يُجمد. تم تنقية الجسم المضاد أحادي النسيلة من سائل مزرعة الأنسجة أو السائل الاستسقائي باستخدام كروماتوغرافيا التقارب. تم ربط الجسم المضاد بـ BD Horizon™ V450 في ظل الظروف المثلى، وتمت إزالة BD Horizon™ V450 غير المتفاعل.
إجراءات التحليل الموصى بها: يُعدّ Annexin V450 V مسبارًا حساسًا لتحديد الخلايا الميتة، حيث يرتبط بأسطح الفوسفوليبيدات سالبة الشحنة (Kd ~5 × 10^-2) بألفة أعلى للفوسفاتيديل سيرين (PS) مقارنةً بمعظم الفوسفوليبيدات الأخرى. يعتمد ارتباط Annexin V450 V على الكالسيوم، لذا يلزم تحديد تركيزات معينة من الكالسيوم والأملاح للحصول على تلوين مثالي، كما هو موضح في بروتوكول تلوين Annexin V450 V. ينبغي على الباحثين ملاحظة أن تحليل التدفق الخلوي باستخدام Annexin V450 V على أنواع الخلايا الملتصقة (مثل HeLa وNIH 3T3 وغيرها) لا يُجرى بشكل روتيني، نظرًا لاحتمالية حدوث تلف محدد في الغشاء أثناء فصل الخلايا أو جمعها. مع ذلك، فقد نُشرت سابقًا طرق لاستخدام Annexin V في قياس التدفق الخلوي على أنواع الخلايا الملتصقة (Casiola-Rosen et al. وvan Engelend et al.). تحفيز موت الخلايا المبرمج بواسطة كامبتوثيسين: يُقدَّم البروتوكول التالي كمثال توضيحي لكيفية استخدام V450 Annexin V على خط خلوي (Jurkat). المواد: 1. تحضير محلول كامبتوثيسين المركز (Sigma-Aldrich Cat. No. C-9911): 1 ملي مولار في DMSO. 2. خلايا Jurkat T (ATCC TIB-152). الإجراء: 1. إضافة كامبتوثيسين (التركيز النهائي 4-6 ميكرومولار) إلى 1 × 10^6 خلية Jurkat. 2. حضانة الخلايا لمدة 4-6 ساعات عند 37 درجة مئوية. 3. اتباع بروتوكول تلوين V450 Annexin V لقياس موت الخلايا المبرمج. بروتوكول تلوين V450 Annexin V: يُستخدم V450 Annexin V لتحديد النسبة المئوية للخلايا التي تخضع لموت الخلايا المبرمج بشكل كمي ضمن مجموعة من الخلايا. تعتمد هذه الطريقة على خاصية فقدان الخلايا لتناظر أغشيتها في المراحل المبكرة من الاستماتة الخلوية. أنيكسين V هو بروتين رابط للفوسفوليبيدات يعتمد على الكالسيوم، وله ألفة عالية للفوسفاتيديل سيرين (PS)، وهو مفيد لتحديد الخلايا المستميتة ذات الفوسفاتيديل سيرين المكشوف. بروبيديوم يوديد (PI) هو مسبار قياسي لقياس حيوية الخلايا باستخدام قياس التدفق الخلوي، ويُستخدم للتمييز بين الخلايا الحية وغير الحية. الكواشف: 1. أنيكسين V450: مُضمّن. استخدم 5 ميكرولتر لكل اختبار. 2. بروبيديوم يوديد (PI): غير مُضمّن. PI (رقم المنتج 556463) هو صبغة حمض نووي سهلة الاستخدام وجاهزة للاستخدام. استخدم حتى 10 ميكرولتر لكل اختبار من محلول تركيزه 50 ميكروغرام/مل. 3. محلول الربط 10×: غير مُضمّن. 0.1 مولار هيبس (الأس الهيدروجيني 7.4)، 1.4 مولار كلوريد الصوديوم، 25 ملي مولار كلوريد الكالسيوم. يُحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية. بدلاً من ذلك، يمكن شراء محلول ربط Annexin V المركز 10X من BD Pharmingen™ (رقم المنتج 556454). التلوين: 1. اغسل الخلايا مرتين بمحلول فوسفات بارد، ثم أعد تعليقها في محلول الربط المركز 1× بتركيز 1 × 10^6 خلية/مل. 2. انقل 100 ميكرولتر من المحلول (1 × 10^5 خلية) إلى أنبوب زراعة سعة 5 مل. 3. أضف 5 ميكرولتر من Annexin V450. 4. أضف 10 ميكرولتر من PI. قد يختلف التركيز الأمثل لـ PI بين سلالات الخلايا، حيث يُرجح أن يكون 10 ميكرولتر من محلول تركيزه 50 ميكروغرام/مل هو الحد الأقصى المطلوب. قد يُعطي استخدام كمية أقل نتائج مثالية في بعض الأنظمة التجريبية. 5. رجّ الخلايا برفق باستخدام جهاز الخلط الدوامي، ثم حضّنها لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (25 درجة مئوية) في الظلام. ٦. أضف ٤٠٠ ميكرولتر من محلول الربط ١× إلى كل أنبوب. حلل باستخدام قياس التدفق الخلوي خلال ساعة واحدة. الضوابط المقترحة لإعداد قياس التدفق الخلوي: تُستخدم الضوابط التالية لضبط التعويض والأرباع: ١. خلايا غير مصبوغة. ٢. خلايا مصبوغة بـ V450 Annexin V (بدون PI). ٣. خلايا مصبوغة بـ PI (بدون V450 Annexin V). ضوابط صبغ أخرى: يجب استخدام سلالة خلوية يسهل تحفيزها على الخضوع للاستماتة للحصول على صبغ تحكم إيجابي باستخدام V450 Annexin V و/أو V450 Annexin V و PI. من المهم ملاحظة أن المستوى الأساسي للاستماتة والنخر يختلف اختلافًا كبيرًا داخل المجموعة الخلوية. وبالتالي، حتى في غياب الاستماتة الخلوية المُستحثة، تحتوي معظم تجمعات الخلايا على نسبة ضئيلة من الخلايا التي تُظهر علامات الاستماتة الخلوية (موجبة لـ V450 Annexin V، سالبة لـ PI أو موجبة لـ V450 Annexin V، موجبة لـ PI). تُستخدم المجموعة غير المُعالجة لتحديد المستوى الأساسي للخلايا المُستميتة والميتة. ثم تُحدد نسبة الخلايا التي حُثّت على الخضوع للاستماتة الخلوية عن طريق طرح نسبة الخلايا المُستميتة في المجموعة غير المُعالجة من نسبة الخلايا المُستميتة في المجموعة المُعالجة. بما أن موت الخلية هو النتيجة النهائية للاستماتة الخلوية، فإن الخلايا في المراحل المتأخرة من الاستماتة الخلوية ستكون ذات غشاء تالف وستُظهر علامات إيجابية لكل من PI وV450 Annexin V. لذا، لا يُميز هذا الفحص بين الخلايا التي خضعت بالفعل للاستماتة الخلوية وتلك التي ماتت نتيجةً لمسار النخر، لأنه في كلتا الحالتين ستُظهر الخلايا الميتة علامات إيجابية لكل من V450 Annexin V وPI.
ملاحظات المنتج: تم تخفيف هذا الكاشف مسبقًا للاستخدام بالحجم الموصى به لكل اختبار. نستخدم عادةً 1 × 10^6 خلية في عينة تجريبية بحجم 100 ميكرولتر (اختبار). مصدر جميع بروتينات المصل هو مسالخ معتمدة من وزارة الزراعة الأمريكية، وتقع في الولايات المتحدة. تحذير: ينتج أزيد الصوديوم حمض الهيدرازويك شديد السمية في الظروف الحمضية. خفف مركبات الأزيد بالماء الجاري قبل التخلص منها لتجنب تراكم رواسب قابلة للانفجار في أنابيب الصرف الصحي. يتميز BD Horizon V450 بامتصاص أقصى عند 406 نانومتر وانبعاث أقصى عند 450 نانومتر. قبل التلوين بهذا الكاشف، يرجى التأكد من أن جهاز قياس التدفق الخلوي الخاص بك قادر على إثارة الفلوركروم وتمييز الفلورة الناتجة. Pacific Blue™ هي علامة تجارية مسجلة لشركة Molecular Probes, Inc.، يوجين، أوريغون. للاطلاع على أطياف الفلوركروم وإعدادات الجهاز المناسبة، يُرجى زيارة صفحة قياس التدفق الخلوي متعدد الألوان على موقعنا الإلكتروني www.bdbiosciences.com/colors. وللاطلاع على البروتوكولات الفنية، يُرجى زيارة www.bdbiosciences.com/us/s/resources.