BD، 561526، مجموعة تحليل السلالة العصبية البشرية BD Stemflow™

التفاعل: بشري (اختبار مراقبة الجودة)
التطبيق: قياس التدفق الخلوي (يتم اختباره بشكل روتيني)
الوضع التنظيمي: للاستخدام البحثي فقط
RRID: AB_2869383
الوصف: تحتوي مجموعة BD Stemflow™ لتحليل السلالة العصبية البشرية على مزيج من الأجسام المضادة وحيدة النسيلة للفأر لتحليل مزارع التمايز العصبي. يوضح الجدول أدناه خصائص الأجسام المضادة المتوفرة في هذه المجموعة وأنواع الخلايا العصبية التي يمكنها تحديدها. يمكن استخدام مكونات الأجسام المضادة في هذه المجموعة بشكل فردي أو في مجموعات تصل إلى أربعة. تم التحقق من جميع الأجسام المضادة في هذه المجموعة باستخدام تقنية Western blot وتحليل الصور. تتوفر صيغ إضافية للأجسام المضادة، والتي تتيح إجراء تحليلات أكثر تعقيدًا، على الموقع الإلكتروني www.bdbiosciences.com. تتضمن المجموعة أيضًا محلول التثبيت BD Cytofix™ ومحلول النفاذية BD Phosflow™ Perm Buffer III. مكونات المجموعة: المكون، الوصف، الحجم. محلول تخزين لكل اختبار 51-9007227 PerCP-Cy™5.5 مضاد Sox2 للفأر، 25 اختبارًا، 5 ميكرولتر، محلول مائي منظم يحتوي على BSA و ≤ 0.09% أزيد الصوديوم. 51-9007228 Alexa Fluor® 647 مضاد GFAP للفأر، 25 اختبارًا، 5 ميكرولتر، محلول مائي منظم يحتوي على BSA و ≤ 0.09% أزيد الصوديوم. 51-9007229 PE مضاد Doublecortin للفأر، 25 اختبارًا، 5 ميكرولتر، محلول مائي منظم يحتوي على BSA و ≤ 0.09% أزيد الصوديوم. 51-9007230 Alexa Fluor® 647 مضاد Nestin للفأر، 25 اختبارًا، 5 ميكرولتر، محلول مائي منظم يحتوي على BSA و ≤ 0.09% أزيد الصوديوم. 51-9007231 ألكسا فلور® 488 مضاد Ki-67 البشري للفأر، اختبار 25، 5 ميكرولتر، محلول مائي منظم يحتوي على BSA و ≤ 0.09% أزيد الصوديوم. 51-9007232 بير سي بي-سي™ 5.5 مضاد Sox1 البشري للفأر، اختبار 25، 5 ميكرولتر، محلول مائي منظم يحتوي على BSA و ≤ 0.09% أزيد الصوديوم. 51-9007233 فيتو-إيزوثيوسيانات مضاد CD44 البشري للفأر، اختبار 25، 5 ميكرولتر، محلول مائي منظم يحتوي على BSA و ≤ 0.09% أزيد الصوديوم. 51-9006607 محلول نفاذية III، 50 مل. 51-9006276 محلول تثبيت، 50 مل. النوعية: مستنسخ، جزيء. تم تحديد مجموعة الخلايا العصبية: CD44، G44-26، H-CAM. الخلايا الدبقية، والخلايا النجمية، وسلائف الخلايا النجمية Ki-67 B56 علامة تكاثر نووية جميع أنواع الخلايا المتكاثرة Doublecortin 30/Doublecortin Neuroflilament الخلايا العصبية غير الناضجة بعد الانقسام Sox2 O30-678 عامل نسخ الخلايا الدبقية، والخلايا الجذعية الجنينية والعصبية Sox1 N23-844 عامل نسخ الخلايا الدبقية والخلايا الجذعية العصبية GFAP 1B4 خيط الخلايا النجمية Nestin 25/Nestin Filament الخلايا الدبقية، والخلايا النجمية، والخلايا الجذعية الجنينية والعصبية
التحضير والتخزين: يُحفظ غير مخفف في درجة حرارة 4 درجات مئوية، ويُحفظ بعيدًا عن الضوء لفترات طويلة. لا يُجمد. تم ربط الجسم المضاد بـ R-PE في ظل الظروف المثلى، وتمت إزالة الجسم المضاد غير المرتبط وPE الحر. تم ربط الجسم المضاد بـ Alexa Fluor® 488 في ظل الظروف المثلى، وتمت إزالة Alexa Fluor® 488 غير المتفاعل. تم ربط الجسم المضاد بـ PerCP-Cy5.5 في ظل الظروف المثلى، وتمت إزالة الجسم المضاد غير المرتبط وPerCP-Cy5.5 الحر. لا يُنصح بتخزين مُقترنات PerCP-Cy5.5 في مُخفف غير مُحسَّن، فقد يؤدي ذلك إلى فقدان شدة الإشارة. تم ربط الجسم المضاد بـ FITC في ظل الظروف المثلى، وتمت إزالة FITC غير المتفاعل. تم ربط الجسم المضاد بـ Alexa Fluor® 647 في ظل الظروف المثلى، وتمت إزالة Alexa Fluor® 647 غير المتفاعل.
إجراءات التحليل الموصى بها: (1) فصل الخلايا المراد تحليلها عن طبق الزراعة. يُنصح الباحثون بفصل الخلايا عند درجة حرارة 37 درجة مئوية باستخدام محلول فصل الخلايا Accutase™ (رقم المنتج 561527). قد يستغرق الفصل ما يصل إلى 45 دقيقة مع تقليب معلق الخلايا برفق إلى متوسط. (2) غسل الخلايا بمحلول فوسفات ملحي (PBS) بتركيز 1X، ثم ترشيحها باستخدام مصفاة خلايا Falcon® بمسام 70 ميكرومتر (رقم المنتج 352350 من Corning). (3) إعادة تعليق الخلايا في محلول تثبيت BD Cytofix™ (رقم المنتج 554655) وحضانتها في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة في الظلام. الحجم الموصى به لتثبيت الخلايا هو 1 مل من محلول تثبيت BD Cytofix™ لكل 10 ملايين خلية، بحد أدنى 200 ميكرولتر. (4) غسل الخلايا مرتين بمحلول فوسفات ملحي (PBS) بتركيز 1X. إذا رغب الباحثون في المتابعة لاحقًا، يمكن تجميد الخلايا وتخزينها في محلول مكون من 10% ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) و90% مصل بقري جنيني (FBS) عند درجة حرارة -80 درجة مئوية باستخدام الطرق القياسية لحفظ الخلايا الحية بالتجميد. (5) يُرجّ المحلول جيدًا لتفكيك الخلايا، ثم تُصبح الخلايا نفاذة بإضافة محلول BD Phosflow™ Perm Buffer III البارد (رقم المنتج 558050) ببطء مع الاستمرار في الرج. الحجم الموصى به لزيادة نفاذية الخلايا هو 1 مل من محلول BD Phosflow™ Perm Buffer III لكل 10 ملايين خلية، بحد أدنى 1 مل. (6) تُحضن الخلايا على الجليد لمدة 30 دقيقة، أو بدلاً من ذلك، يمكن تخزينها في محلول BD Phosflow™ Perm Buffer III لمدة تصل إلى 6 أشهر عند درجة حرارة -20 درجة مئوية. (7) اغسل الخلايا مرتين بمحلول التلوين BD Pharmingen™ (FBS) (رقم المنتج 554656) وأعد تعليقها بتركيز 5-10 ملايين خلية/مل في محلول التلوين BD Pharmingen™ (FBS). بدلاً من ذلك، يمكن استخدام محلول الغسل/التلوين 1X (محلول فوسفات ملحي 1X، 1% مصل جنيني بقري، و0.09% أزيد الصوديوم). (8) أضف 100 ميكرولتر من الخلايا إلى أنابيب البوليسترين 12 × 75 مم المُعَلَّمة بشكل مناسب. (9) أضف مجموعة الأجسام المضادة المُقترنة التي ترغب في استخدامها (5 ميكرولتر/اختبار من كل جسم مضاد مُقترن) واحضنها في الظلام لمدة 30 دقيقة. (10) اغسل مرتين بـ 2 مل من محلول التلوين BD Pharmingen™ (FBS). (11) أعد تعليق العينة في حجم مناسب (350-400 ميكرولتر) من محلول التلوين BD Pharmingen™ (FBS) لتشغيلها على جهاز قياس التدفق الخلوي. اعتبارات المجموعة: اختيار إنزيم فصل الخلايا: يُنصح الباحثون باستخدام محلول فصل الخلايا Accutase™ (رقم المنتج 561527)، حيث لوحظ أن موت الخلايا مع هذه الطريقة ضئيل للغاية. يمكن استخدام طرق أخرى حسب كثافة الخلايا وعددها، مثل استخدام التربسين بتركيز 0.05%. طرق التثبيت والنفاذية: جميع مكونات هذه المجموعة متوافقة مع بعضها البعض. مع ذلك، في حال إضافة خصائص نوعية إضافية، يجب التحقق من توافق الأجسام المضادة المقترنة مع محاليل التثبيت/النفاذية المضمنة في هذه المجموعة. إعداد الجهاز: قد تكون جزيئات BD™ CompBead Plus (رقم المنتج 560497 أو 560499) مفيدة في إعداد التجربة على جهاز قياس التدفق الخلوي. يُنصح الباحثون بضبط جهد أنابيب التضخيم الضوئي (PMT) باستخدام جزيئات BD™ CompBead Plus، ثم التحقق من ملاءمة إعدادات الجهد عن طريق تشغيل عينة من الخلايا المصبوغة قبل بدء التجربة كاملةً. تحليل البيانات: يُوصى باتباع نهج البوابات العنقودية عند تحليل البيانات. قد يكون الرجوع إلى ملف تعريف التشتت مفيدًا نظرًا لوجود مجموعة تشتت مميزة للخلايا العصبية. في العديد من مزارع التمايز العصبي، قد يستغرق التعبير عن بروتين GFAP وقتًا طويلاً جدًا (أكثر من شهر). لاحظنا أنه يمكن تعزيز التعبير عن GFAP عن طريق زراعة الخلايا في أوساط مُصممة لنمو الخلايا النجمية (انظر أدناه). قد تتسرب بقايا الخلايا أحيانًا إلى مجموعة الخلايا العصبية، ويمكن أن يكون استخدام مُحددات الخلايا الحية والميتة مفيدًا لتحديد مجموعة الخلايا العصبية. مجموعات الخلايا: طُوّرت هذه المجموعة للاستخدام على مجموعات الخلايا العصبية المُشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات البشرية باستخدام الطرق الموضحة في شرح الشكل أدناه. لم يتم اختبار هذه المجموعة على أنواع خلايا أخرى، بما في ذلك الخلايا الأولية، وقد تختلف النتائج عند فحص أنواع خلايا ذات أصل مختلف (مثل زيادة التلوين الخلفي). في هذه الحالات، قد يجد الباحثون أنه من المفيد استخدام ضوابط النمط المتساوي للتمييز بين التلوين الخلفي غير المحدد والتلوين بالأجسام المضادة النوعية. تحذيرات واحتياطات: خطر: يحتوي محلول BD Phosflow™ Perm Buffer III (المكون 51-9006607) على 87.68% ميثانول (وزن/وزن). بيانات المخاطر: سائل وبخار شديد الاشتعال. سام عند البلع أو ملامسة الجلد أو الاستنشاق. يسبب تلفًا للجهاز العصبي المركزي. طريقة التعرض: عن طريق الفم. بيانات الاحتياطات: يُحفظ بعيدًا عن الحرارة/الشرر/اللهب المكشوف/الأسطح الساخنة. ممنوع التدخين. ارتدِ ملابس واقية/واقي للعينين. ارتدِ قفازات واقية. لا تستنشق الرذاذ/الأبخرة. في حالة ملامسة الجلد (أو الشعر): انزع/أزل جميع الملابس الملوثة فورًا. اشطف الجلد بالماء/استحم. في حالة الاستنشاق: انقل المصاب إلى الهواء الطلق وأبقِه في وضع مريح للتنفس. خطر: يحتوي محلول التثبيت (المكون 51-9006276) على 4.2% فورمالديهايد (وزن/وزن). بيانات المخاطر: ضار عند الاستنشاق. يسبب تهيج الجلد. يسبب تلفًا خطيرًا للعين. قد يسبب رد فعل تحسسي للجلد. يُشتبه في أنه يسبب عيوبًا وراثية. قد يسبب السرطان. طريقة التعرض: الاستنشاق. قد يسبب تهيجًا في الجهاز التنفسي. بيانات التحذير: ارتدِ ملابس واقية/واقي للعينين. ارتدِ قفازات واقية. لا تستنشق الرذاذ/الأبخرة/البخاخ. في حالة ملامسة العينين: اشطفهما بحذر بالماء لعدة دقائق. أزل العدسات اللاصقة، إن وجدت ويسهل إزالتها. استمر في الشطف. في حالة حدوث تهيج أو طفح جلدي: استشر طبيبًا/اطلب العناية الطبية.
إشعارات المنتج: يُرجى مراعاة الاحتياطات التالية: قد يؤدي امتصاص الضوء المرئي إلى تغيير كبير في نقل الطاقة في أي مُقترن فلوري مزدوج؛ لذا، نوصي باتخاذ احتياطات خاصة (مثل تغليف القوارير أو الأنابيب أو الحوامل بورق الألومنيوم) لمنع تعريض الكواشف المُقترنة، بما في ذلك الخلايا المصبوغة بهذه الكواشف، لإضاءة الغرفة. يتم جمع انبعاث فلوروكروم Alexa Fluor® 488 بنفس إعدادات الجهاز المستخدمة لفلوريسين إيزوثيوسيانات (FITC). يتم جمع انبعاث فلوروكروم Alexa Fluor® 647 بنفس إعدادات الجهاز المستخدمة لألوفيوكوسيانين (APC). Alexa Fluor® علامة تجارية مسجلة لشركة Molecular Probes, Inc.، يوجين، أوريغون. تُباع مُقترنات الأجسام المضادة المُوسومة بصبغات Alexa Fluor® و Pacific Blue™ و Cascade Blue® في هذا المنتج بموجب ترخيص من شركة Molecular Probes, Inc. للاستخدام البحثي فقط، باستثناء استخدامها مع المصفوفات الدقيقة أو ككواشف مُخصصة لتحليل مُعين. وتخضع صبغات Alexa Fluor® (باستثناء Alexa Fluor® 430) و Pacific Blue™ و Cascade Blue® لبراءات اختراع قيد الانتظار وصادرة. ويمكن استخدام الأجسام المضادة المُوسومة بـ PerCP-Cy5.5 مع الكواشف المُوسومة بـ FITC و R-PE في أجهزة قياس التدفق الخلوي أحادية الليزر دون تداخل طيفي يُذكر بين تألق PerCP-Cy5.5 و FITC و R-PE. وقد تم تحسين PerCP-Cy5.5 للاستخدام مع ليزر أيون الأرجون الأحادي الذي يُصدر ضوءًا بطول موجي 488 نانومتر. نظراً لطيف الامتصاص الواسع للفلوروكروم المزدوج، يجب توخي الحذر الشديد عند استخدام أجهزة قياس التدفق الخلوي ثنائية الليزر، حيث قد تُثير هذه الأجهزة كلاً من PerCP وCy5.5™ بشكل مباشر. نوصي باستخدام تعويض الحزمة المتقاطعة أثناء جمع البيانات أو التعويض البرمجي أثناء تحليلها. يُباع هذا المنتج المُقترن بـ PerCP بموجب ترخيص من براءة الاختراع الأمريكية رقم 4,876,190. Cy هي علامة تجارية مسجلة لشركة Amersham Biosciences Limited. يُباع هذا المنتج المُقترن بموجب ترخيص من براءات الاختراع الأمريكية أرقام 5,486,616 و5,569,587 و5,569,766 و5,627,027. يخضع هذا المنتج لحقوق الملكية الفكرية لشركة Amersham Biosciences Corp. وجامعة كارنيجي ميلون، ويتم تصنيعه وبيعه بموجب ترخيص من شركة Amersham Biosciences Corp. هذا المنتج مُرخص للبيع لأغراض البحث العلمي فقط، ولا يُرخص لأي استخدام آخر. إذا كنتَ بحاجة إلى ترخيص تجاري لاستخدام هذا المنتج ولم يكن لديك ترخيص، فيُرجى إعادة هذه المادة، غير مفتوحة، إلى شركة BD Biosciences، 10975 Torreyana Rd، سان دييغو، كاليفورنيا 92121، وسيتم ردّ أي مبلغ مدفوع مقابلها. مصدر جميع بروتينات المصل هو مسالخ معتمدة من وزارة الزراعة الأمريكية، وتقع في الولايات المتحدة. تنبيه: ينتج أزيد الصوديوم حمض الهيدرازويك شديد السمية في الظروف الحمضية. خفف مركبات الأزيد بالماء الجاري قبل التخلص منها لتجنب تراكم رواسب قابلة للانفجار في أنابيب الصرف الصحي. للاطلاع على أطياف الفلوركروم وإعدادات الجهاز المناسبة، يُرجى زيارة صفحة قياس التدفق الخلوي متعدد الألوان على موقعنا الإلكتروني www.bdbiosciences.com/colors. للاطلاع على البروتوكولات الفنية، يُرجى زيارة www.bdbiosciences.com/us/s/resources.