BD، 562496، مجموعة تحليل الأديم الباطن البشري النهائي والبنكرياسي BD Stemflow™

التفاعل: بشري (اختبار مراقبة الجودة)
التطبيق: التلوين داخل الخلايا (قياس التدفق الخلوي) (يتم اختباره بشكل روتيني)
الوضع التنظيمي: للاستخدام البحثي فقط
RRID: AB_2869421
الوصف: تحتوي مجموعة BD Stemflow™ لتحليل الأديم الباطن البشري النهائي والبنكرياسي على مزيج من الأجسام المضادة وحيدة النسيلة المُقترنة بالفئران لتحليل مزارع تمايز الأديم الباطن النهائي والبنكرياسي. ترد في الجدول أدناه خصائص الأجسام المضادة المتوفرة في هذه المجموعة وأنواع الخلايا التي يمكنها تحديدها. يمكن استخدام مكونات الأجسام المضادة في هذه المجموعة بشكل فردي أو في مجموعات تصل إلى أربعة. تتوفر صيغ إضافية للأجسام المضادة تُمكّن من إجراء تحليلات أكثر تعقيدًا على الموقع الإلكتروني www.bdbiosciences.com. تتضمن المجموعة أيضًا محلول التثبيت BD Cytofix™ ومحلول النفاذية BD Phosflow™ Perm Buffer III. مكونات المجموعة: المكون، الوصف، الحجم. محلول تخزين لكل اختبار 51-9008006 Alexa Fluor® 488 مضاد Pax-6 البشري للفأر، 25 اختبارًا، 5 ميكرولتر، محلول مائي منظم يحتوي على BSA و ≤0.09% أزيد الصوديوم. 51-9008007 PE مضاد PDX-1 للفأر، 25 اختبارًا، 5 ميكرولتر، محلول مائي منظم يحتوي على BSA و ≤0.09% أزيد الصوديوم. 51-9008008 PE مضاد FoxA2 البشري للفأر، 25 اختبارًا، 5 ميكرولتر، محلول مائي منظم يحتوي على BSA و ≤0.09% أزيد الصوديوم. 51-9007227 PerCP-Cy™5.5 مضاد Sox2 للفأر، 25 اختبارًا، 5 ميكرولتر، محلول مائي منظم يحتوي على BSA و ≤0.09% أزيد الصوديوم. 51-9008009 PerCP-Cy™5.5 مضاد الفأر لـ Sox17 البشري، اختبار 25، 5 ميكرولتر، محلول مائي منظم يحتوي على BSA و ≤0.09% أزيد الصوديوم، 51-9008010. Alexa Fluor® 647 مضاد الفأر لـ Nanog البشري، اختبار 25، 5 ميكرولتر، محلول مائي منظم يحتوي على BSA و ≤0.09% أزيد الصوديوم، 51-9006607. محلول Perm Buffer III، 50 مل، 51-9006276. محلول التثبيت، 50 مل. النوعية: Nanog N31-335، خلايا جذعية متعددة القدرات. Sox2 O30-678، خلايا جذعية متعددة القدرات، شوائب الأديم الظاهر. Sox17 P7-969، الأديم الباطن المحدد. FoxA2 N17-280، الأديم الباطن المحدد. Pax6 O30-1330 الأديم الباطن البنكرياسي، الملوثات الأديمية الظاهرة Pdx1 658A5 الأديم الباطن البنكرياسي
التحضير والتخزين: يُحفظ غير مخفف في درجة حرارة 4 درجات مئوية، ويُحفظ بعيدًا عن الضوء لفترات طويلة. لا يُجمد. تم ربط الجسم المضاد بـ R-PE في ظل الظروف المثلى، وتمت إزالة الجسم المضاد غير المرتبط وPE الحر. تم ربط الجسم المضاد بـ Alexa Fluor® 488 في ظل الظروف المثلى، وتمت إزالة Alexa Fluor® 488 غير المتفاعل. تم ربط الجسم المضاد بـ PerCP-Cy5.5 في ظل الظروف المثلى، وتمت إزالة الجسم المضاد غير المرتبط وPerCP-Cy5.5 الحر. لا يُنصح بتخزين مُقترنات PerCP-Cy5.5 في مُخفف غير مُحسَّن، فقد يؤدي ذلك إلى فقدان شدة الإشارة. تم ربط الجسم المضاد بـ FITC في ظل الظروف المثلى، وتمت إزالة FITC غير المتفاعل. تم ربط الجسم المضاد بـ Alexa Fluor® 647 في ظل الظروف المثلى، وتمت إزالة Alexa Fluor® 647 غير المتفاعل.
إجراءات الفحص الموصى بها: 1. فصل الخلايا المراد فحصها عن طبق الزراعة. يُنصح الباحثون بفصل الخلايا عند درجة حرارة 37 درجة مئوية باستخدام محلول فصل الخلايا Accutase™ (رقم المنتج 561527). يُوصى بتقليب معلق الخلايا برفق إلى متوسط ​​للحصول على معلق خلوي أحادي. 2. غسل الخلايا في محلول فوسفات ملحي (PBS) بتركيز 1X. في حال وجود تكتلات، يمكن ترشيح الخلايا باستخدام مصفاة خلايا Falcon® بقطر 70 مم (رقم المنتج 352350 من Corning). 3. إعادة تعليق الخلايا في محلول تثبيت BD Cytofix™ بتركيز 0.5X (رقم المنتج 554655) المخفف في محلول فوسفات ملحي (PBS) بتركيز 1X، ثم حضنها عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. الحجم الموصى به لتثبيت الخلايا هو 1 مل من محلول التثبيت لكل 10 ملايين خلية، بحد أدنى 200 ميكرولتر. ٤. اغسل الخلايا مرتين بمحلول فوسفات الصوديوم المخفف (PBS) بتركيز ١X. إذا رغب الباحثون في المتابعة لاحقًا، يمكن تجميد الخلايا وتخزينها في محلول مكون من ١٠٪ ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) و٩٠٪ مصل بقري جنيني (FBS) عند درجة حرارة -٨٠ درجة مئوية باستخدام الطرق القياسية لحفظ الخلايا الحية بالتجميد. ٥. رجّ الخلايا جيدًا لتفكيكها، ثم اجعلها نفاذة بإضافة محلول BD Phosflow™ Perm Buffer III البارد (رقم المنتج ٥٥٨٠٥٠) ببطء مع الاستمرار في الرج. الحجم الموصى به لجعل الخلايا نفاذة هو ١ مل من محلول BD Phosflow™ Perm Buffer III لكل ١٠ ملايين خلية، بحد أدنى ١ مل. ٦. حضّن الخلايا على الجليد لمدة ٣٠ دقيقة، أو بدلاً من ذلك، يمكن تخزينها في محلول BD Phosflow Perm Buffer III لمدة تصل إلى ٦ أشهر عند درجة حرارة -٢٠ درجة مئوية. ٧. اغسل الخلايا مرتين بمحلول التلوين BD Pharmingen™ (FBS) (رقم المنتج ٥٥٤٦٥٦) وأعد تعليقها بتركيز ٥-١٠ ملايين خلية/مل في محلول التلوين BD Pharmingen™ (FBS). بدلاً من ذلك، يمكن استخدام محلول الغسل/التلوين بتركيز ١X (محلول فوسفات ملحي ١X، ١٪ مصل جنيني بقري، و٠.٠٩٪ أزيد الصوديوم). ٨. أضف ١٠٠ ميكرولتر من الخلايا إلى أنابيب البوليسترين ١٢ × ٧٥ مم المُعَلَّمة بشكل مناسب. ٩. أضف مجموعة الأجسام المضادة المُقترنة التي ترغب في استخدامها (٥ ميكرولتر/اختبار من كل جسم مضاد مُقترن) واحضنها في الظلام لمدة ٣٠ دقيقة. ١٠. اغسل مرتين بـ ٢ مل من محلول التلوين BD Pharmingen™ (FBS). ١١. أعد تعليق العينة في حجم مناسب (٣٥٠-٤٠٠ ميكرولتر) من محلول التلوين BD Pharmingen™ (FBS) لتشغيلها على جهاز قياس التدفق الخلوي. اعتبارات المجموعة: اختيار إنزيم فصل الخلايا: يُنصح الباحثون باستخدام محلول فصل الخلايا Accutase™ (رقم المنتج ٥٦١٥٢٧)، حيث لوحظ أن موت الخلايا مع هذه الطريقة ضئيل للغاية. طرق التثبيت والنفاذية: جميع مكونات هذه المجموعة متوافقة مع بعضها البعض. مع ذلك، في حال إضافة خصائص نوعية إضافية، يجب التحقق من توافق الأجسام المضادة المقترنة مع محاليل التثبيت/النفاذية المضمنة في هذه المجموعة. إضافة علامات سطح الخلية: تم استخدام CD184 PE (رقم المنتج 555974)، وCD184 APC (رقم المنتج 555976)، وCD184 BV421 (رقم المنتج 562448) بنجاح مع مكونات هذه المجموعة. مع ذلك، نظرًا لظهور تلوين خلفي غير نوعي على الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي تم تثبيتها ثم تلوينها بـ CD184، يُوصى بفصل الخلايا، وتلوينها وهي حية بـ CD184، وتثبيتها كما هو موصى به أعلاه، ثم نفاذيتها باستخدام 0.1% من Triton™ X-100 (قد يؤثر Perm III سلبًا على التلوين الإيجابي لـ CD184)، ثم تلوينها للكشف عن العلامات داخل الخلوية. إعداد الجهاز: قد تكون جزيئات BD™ CompBead Plus (رقم المنتج 560497) مفيدة في إعداد التجربة على جهاز قياس التدفق الخلوي. يُنصح الباحثون بضبط جهد أنابيب التضخيم الضوئي (PMT) باستخدام جزيئات BD™ CompBead Plus، ثم التحقق من ملاءمة إعدادات الجهد عن طريق تشغيل عينة من الخلايا المصبوغة قبل بدء التجربة كاملةً. تحليل البيانات: يُوصى باتباع نهج البوابات العنقودية عند تحليل البيانات. مجموعات الخلايا: طُوّرت هذه المجموعة للاستخدام على مجموعات خلايا الأديم الباطن المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات البشرية باستخدام الطرق الموضحة في شرح الأشكال أدناه. لم تُختبر هذه المجموعة على أنواع خلايا أخرى، بما في ذلك الخلايا الأولية، وقد تختلف النتائج عند فحص أنواع خلايا ذات أصل مختلف (مثل زيادة التلوين الخلفي). في هذه الحالات، قد يجد الباحثون أنه من المفيد استخدام ضوابط النمط المتساوي للتمييز بين التلوين الخلفي غير المحدد والتلوين بالأجسام المضادة النوعية. تحذيرات واحتياطات: خطر: يحتوي محلول BD Phosflow™ Perm Buffer III (المكون 51-9006607) على 87.68% ميثانول (وزن/وزن). بيانات المخاطر: سائل وبخار شديد الاشتعال. سام عند البلع أو ملامسة الجلد أو الاستنشاق. يُسبب تلفًا للجهاز العصبي المركزي. طريقة التعرض: عن طريق الفم. احتياطات السلامة: يُحفظ بعيدًا عن الحرارة/الشرر/اللهب المكشوف/الأسطح الساخنة. ممنوع التدخين. ارتدِ ملابس واقية/واقي للعينين. ارتدِ قفازات واقية. لا تستنشق الرذاذ/الأبخرة. في حالة ملامسة الجلد (أو الشعر): انزع/اخلع جميع الملابس الملوثة فورًا. اغسل الجلد بالماء/استحم. في حالة الاستنشاق: انقل المصاب إلى الهواء الطلق وأبقِه في وضع مريح للتنفس. خطر: يحتوي محلول تثبيت BD Cytofix™ (المكون 51-9006276) على 4.2% فورمالديهايد (وزن/وزن). بيانات المخاطر: ضار عند الاستنشاق. يُسبب تهيجًا للجلد. يُسبب تلفًا خطيرًا للعين. قد يُسبب رد فعل تحسسي للجلد. يُشتبه في أنه يُسبب عيوبًا وراثية. قد يُسبب السرطان. طريقة التعرض: عن طريق الاستنشاق. قد يُسبب تهيجًا للجهاز التنفسي. إرشادات السلامة: ارتدِ ملابس واقية/نظارات واقية. ارتدِ قفازات واقية. تجنب استنشاق الرذاذ/الأبخرة. في حالة ملامسة العينين: اشطفهما جيدًا بالماء لعدة دقائق. أزل العدسات اللاصقة، إن وجدت وكان من السهل إزالتها. استمر في الشطف. في حالة حدوث تهيج أو طفح جلدي: استشر طبيبًا.
إشعارات المنتج: يرجى مراعاة الاحتياطات التالية: قد يؤدي امتصاص الضوء المرئي إلى تغيير كبير في نقل الطاقة في أي مركب فلوري مزدوج؛ لذلك، نوصي باتخاذ احتياطات خاصة (مثل تغليف القوارير أو الأنابيب أو الحوامل بورق الألومنيوم) لمنع تعرض الكواشف المقترنة، بما في ذلك الخلايا المصبوغة بهذه الكواشف، لإضاءة الغرفة. يتم جمع انبعاث فلوروكروم Alexa Fluor® 488 بنفس إعدادات الجهاز المستخدمة مع إيزوثيوسيانات الفلورسين (FITC). يمكن استخدام الأجسام المضادة الموسومة بـ PerCP-Cy5.5 مع الكواشف الموسومة بـ FITC وR-PE في أجهزة قياس التدفق الخلوي أحادية الليزر دون تداخل طيفي كبير بين فلورة PerCP-Cy5.5 وFITC وR-PE. تم تحسين PerCP-Cy5.5 للاستخدام مع ليزر أيون الأرجون الأحادي الذي ينبعث منه ضوء بطول موجي 488 نانومتر. نظراً لطيف الامتصاص الواسع للفلوروكروم المزدوج، يجب توخي الحذر الشديد عند استخدام أجهزة قياس التدفق الخلوي ثنائية الليزر، حيث قد تُثير هذه الأجهزة كلاً من PerCP وCy5.5™ بشكل مباشر. نوصي باستخدام تعويض الحزمة المتقاطعة أثناء جمع البيانات أو التعويض البرمجي أثناء تحليلها. يتم جمع انبعاث فلوروكروم Alexa Fluor® 647 بنفس إعدادات الجهاز المستخدمة مع الألوفيوكوسيانين (APC). Accutase هي علامة تجارية مسجلة لشركة Innovative Cell Technologies, Inc.، وAlexa Fluor® هي علامة تجارية مسجلة لشركة Molecular Probes, Inc.، يوجين، أوريغون. تُباع مُقترنات الأجسام المضادة المصبوغة بـ Alexa Fluor® وPacific Blue™ وCascade Blue® في هذا المنتج بموجب ترخيص من شركة Molecular Probes, Inc. للاستخدام البحثي فقط، باستثناء استخدامها مع المصفوفات الدقيقة أو ككواشف خاصة بالمادة المُحللة. تخضع أصباغ Alexa Fluor® (باستثناء Alexa Fluor® 430)، وصبغة Pacific Blue™، وصبغة Cascade Blue® لبراءات اختراع قيد الانتظار وصادرة. يُباع هذا المنتج المُقترن بـ PerCP بموجب ترخيص لبراءة الاختراع الأمريكية رقم 4,876,190. Cy هي علامة تجارية مسجلة لشركة Amersham Biosciences Limited. يُباع هذا المنتج المُقترن بموجب ترخيص لبراءات الاختراع الأمريكية أرقام 5,486,616، و5,569,587، و5,569,766، و5,627,027. يخضع هذا المنتج لحقوق الملكية الفكرية لشركة Amersham Biosciences Corp. وجامعة كارنيجي ميلون، ويتم تصنيعه وبيعه بموجب ترخيص من شركة Amersham Biosciences Corp. هذا المنتج مُرخص للبيع لأغراض البحث العلمي فقط، ولا يُرخص لأي استخدام آخر. إذا كنتَ بحاجة إلى ترخيص تجاري لاستخدام هذا المنتج ولم يكن لديك ترخيص، فيُرجى إعادة هذه المادة، غير مفتوحة، إلى شركة BD Biosciences، 10975 Torreyana Rd، سان دييغو، كاليفورنيا 92121، وسيتم ردّ أي مبلغ مدفوع مقابلها. مصدر جميع بروتينات المصل هو مسالخ معتمدة من وزارة الزراعة الأمريكية، وتقع في الولايات المتحدة. تنبيه: ينتج أزيد الصوديوم حمض الهيدرازويك شديد السمية في الظروف الحمضية. خفف مركبات الأزيد بالماء الجاري قبل التخلص منها لتجنب تراكم رواسب قابلة للانفجار في أنابيب الصرف الصحي. للاطلاع على أطياف الفلوركروم وإعدادات الجهاز المناسبة، يُرجى زيارة صفحة قياس التدفق الخلوي متعدد الألوان على موقعنا الإلكتروني www.bdbiosciences.com/colors. للاطلاع على البروتوكولات الفنية، يُرجى زيارة www.bdbiosciences.com/us/s/resources.