BD، 562626، مجموعة BD Stemflow™ لتحليل وفرز الخلايا الجذعية المحفزة متعددة القدرات البشرية

التفاعل: بشري (اختبار مراقبة الجودة)
التطبيق: قياس التدفق الخلوي (يتم اختباره بشكل روتيني)
الوضع التنظيمي: للاستخدام البحثي فقط
RRID: AB_2869428
الوصف: تحتوي مجموعة BD Stemflow™ لفرز وتحليل الخلايا الجذعية المحفزة متعددة القدرات البشرية على مزيج من الأجسام المضادة وحيدة النسيلة للفأر لفرز وتحليل مزارع الخلايا الجذعية المحفزة متعددة القدرات البشرية (hiPSC) والخلايا التي تخضع لعملية إعادة البرمجة. باتباع بروتوكولات إعادة البرمجة المعتمدة، يتم فرز أو تحليل خلايا hiPSC من مزرعة خلوية غير متجانسة باستخدام الأجسام المضادة المرفقة والمرتبطة بثلاثة مؤشرات سطحية للخلايا. ترد في الجدول أدناه خصائص الأجسام المضادة المتوفرة في هذه المجموعة وأنواع الخلايا التي يمكنها تحديدها. تتضمن المجموعة أيضًا عناصر تحكم من نفس النوع وBD™ CompBead Plus. تتوفر صيغ إضافية للأجسام المضادة التي تتيح إجراء تحليلات أكثر تعقيدًا على الموقع الإلكتروني www.bdbiosciences.com. مكونات المجموعة: المكون، الوصف، الحجم، الحجم الحجمي. محلول تخزين لكل اختبار 51-9008175 PerCP-Cy™5.5 مضاد CD13 بشري من الفأر، 50 اختبار، 5 ميكرولتر، محلول مائي منظم يحتوي على BSA و ≤0.09% أزيد الصوديوم. 51-9008176 Alexa Fluor® 647 مضاد SSEA-4 من الفأر، 50 اختبار، 5 ميكرولتر، محلول مائي منظم يحتوي على BSA و ≤0.09% أزيد الصوديوم. 51-9008177 PE مضاد TRA-1-60 بشري من الفأر، 50 اختبار، 5 ميكرولتر، محلول مائي منظم يحتوي على مثبت بروتين، BSA و ≤0.09% أزيد الصوديوم. 51-9008178 PerCP-Cy™5.5 ضابط نمط IgG1، κ من الفأر، 50 اختبار، 5 ميكرولتر، محلول مائي منظم يحتوي على BSA و ≤0.09% أزيد الصوديوم 51-9008179 Alexa Fluor® 647 Mouse IgG3, κ Isotype Control 50 Test 5 µl محلول مائي منظم يحتوي على BSA و ≤0.09% أزيد الصوديوم 51-9008180 PE Mouse IgM, κ Isotype Control 50 Test 5 µl محلول مائي منظم يحتوي على BSA و ≤0.09% أزيد الصوديوم 51-9006227 Negative Control (PBS with 1% BSA) CompBead Plus 6 ml 1 drop a water buffering solution contains BSA and ≤0.09% أزيد الصوديوم 51-9006274 Anti-Mouse Ig, κ CompBead Plus 6 ml 1 drop a water buffering solution contains BSA and ≤0.09% أزيد الصوديوم تم تحديد نوع الأزيد، ونمط الاستنساخ، ومجموعة الخلايا، وCD13 WM15، وهي خلايا ليفية غير مُعاد برمجتها، وTRA-1-60 TRA-1-60.1، وهي خلايا جذعية متعددة القدرات، وSSEA-4 MC-813-70.1، وهي خلايا جذعية متعددة القدرات.
التحضير والتخزين: يُحفظ غير مخفف في درجة حرارة 4 درجات مئوية، ويُحفظ بعيدًا عن الضوء لفترات طويلة. لا يُجمد. تم ربط الجسم المضاد بـ R-PE في ظل الظروف المثلى، وتمت إزالة الجسم المضاد غير المرتبط وPE الحر. تم ربط الجسم المضاد بـ PerCP-Cy5.5 في ظل الظروف المثلى، وتمت إزالة الجسم المضاد غير المرتبط وPerCP-Cy5.5 الحر. لا يُنصح بتخزين مُقترنات PerCP-Cy5.5 في مُخفف غير مُحسَّن، فقد يؤدي ذلك إلى فقدان شدة الإشارة. تم ربط الجسم المضاد بـ Alexa Fluor® 647 في ظل الظروف المثلى، وتمت إزالة Alexa Fluor® 647 غير المتفاعل.
إجراءات التحليل الموصى بها: تم اختبار هذه المجموعة على خلايا ليفية من القلفة مُعاد برمجتها في نظام خالٍ من الخلايا المغذية باستخدام مزيج من الجزيئات الصغيرة، SMC4 (للمزيد من التفاصيل، يُرجى مراجعة Valamehr et al, 2012). باستخدام هذه المجموعة، تم عزل الخلايا باستخدام فرز الخلايا المنشط بالفلورة (FACS) في مرحلة مبكرة، بعد حوالي 20 يومًا من عملية النقل الجيني. تمت زراعة الخلايا التي تم فرزها بكميات كبيرة في هذه المرحلة. بعد حوالي 30 يومًا من عملية النقل الجيني، تم فرز الخلايا بكميات كبيرة وبشكل فردي. نظرًا لاختلاف الخلايا وطرق إعادة البرمجة والمسارات الزمنية، فقد تختلف عمليات الفرز المحددة وأوقات التحليل والنتائج. إرشادات تحليل الخلايا: (1) افصل الخلايا المطلوبة من طبق الزراعة. يُنصح الباحثون بفصل الخلايا عند درجة حرارة 37 درجة مئوية باستخدام محلول فصل الخلايا Accutase™ (رقم المنتج 561527). يُوصى بطحن معلق الخلايا طحنًا خفيفًا إلى متوسط ​​للحصول على معلق خلوي فردي. (2) استخدم وسطًا زراعيًا أو محلول فوسفات ملحي مخفف (PBS) لإزالة الخلايا المتبقية من الطبق. في حال وجود تكتلات، يمكن ترشيح الخلايا باستخدام مصفاة خلايا BD Falcon™ بقطر 70 مم (رقم المنتج 352350). (3) اجمع الخلايا وقم بترسيبها بالطرد المركزي. (4) أعد تعليق الخلايا بتركيز 5-10 ملايين خلية/مل في محلول BD Pharmingen™ Stain Buffer (FBS) (رقم المنتج 554656). بدلاً من ذلك، يمكن استخدام محلول يحتوي على محلول فوسفات ملحي مخفف (PBS) بتركيز 1x، و1% مصل جنيني بقري (FCS)، و0.09% أزيد الصوديوم. (5) ضع علامات على الأنابيب وأضف الأجسام المضادة المقترنة المناسبة كما هو موضح أدناه. قبل استخدام Vortex CompBead Plus: أضف ملصق الأنبوب (اختبار واحد أو قطرة واحدة) 1. تعويض غير مُعلَّم: CompBead Plus سلبي + CompBead Plus مضاد للفأر 2. تعويض PE: CompBead Plus سلبي + CompBead Plus مضاد للفأر + TRA-1-60 PE 3. تعويض PerCP-Cy™5.5: CompBead Plus سلبي + CompBead Plus مضاد للفأر + CD13 PerCP-Cy™5.5 4. تعويض Alexa Fluor® 647: CompBead Plus سلبي + CompBead Plus مضاد للفأر + SSEA-4 Alexa Fluor® 647 5. خلايا فقط: لا شيء 6. عنصر تحكم متماثل النمط: Ms IgGM PE + Ms IgG1 PerCP-Cy5.5 + Ms IgG3 Alexa Fluor® 647 7. عينة التحليل: TRA-1-60 PE + CD13 PerCP-Cy5.5 + SSEA-4 Alexa Fluor® ٦٤٧ (٦) أضف ١٠٠ ميكرولتر من الخلايا إلى أنابيب البوليسترين ذات الأبعاد ١٢ × ٧٥ مم والمُعَلَّمة بشكل مناسب. (٧) حضِّن في الظلام لمدة ٣٠ دقيقة. (٨) اغسل مرتين باستخدام ٢ مل من محلول التلوين BD Pharmingen™ (FBS). (٩) أعد تعليق العينة في حجم مناسب (٣٥٠-٤٠٠ ميكرولتر) من محلول التلوين BD Pharmingen™ (FBS) لتشغيلها على جهاز قياس التدفق الخلوي. إرشادات فرز الخلايا (جميع الخطوات تُنفَّذ باستخدام تقنيات معقمة) (١) افصل الخلايا المطلوبة من طبق الزرع. يُنصح الباحثون بفصل الخلايا عند درجة حرارة ٣٧ درجة مئوية باستخدام محلول فصل الخلايا Accutase™ (رقم المنتج ٥٦١٥٢٧). يُوصى بطحن معلق الخلايا طحنًا خفيفًا إلى متوسط ​​للحصول على معلق خلوي أحادي. (٢) استخدم الوسط لإزالة الخلايا المتبقية من الطبق. في حال وجود تكتلات، يمكن ترشيح الخلايا باستخدام مصفاة خلايا BD Falcon™ بقطر 70 مم (رقم المنتج 352350). (3) اجمع الخلايا وقم بترسيبها بالطرد المركزي. (4) أعد تعليق الخلايا بتركيز يتراوح بين 5 و10 ملايين خلية/مل في محلول الفرز المناسب. في هذه الحالة، استخدمنا محلول HBSS/4%FBS/10 مليمولار HEPES/1X Pen/Strep/10 ميكرومولار Thiazovivin. (5) استخدم أنابيب معقمة بقياس 12×75 مم مزودة بأغطية. قم بتسمية الأنابيب وأضف الأجسام المضادة المقترنة المناسبة كما هو موضح أدناه: الأنبوب التسمية الإضافة (اختبار واحد أو قطرة واحدة) 1. تعويض غير موسوم سلبي CompBead plus + مضاد للفأر Compbead plus 2. تعويض PE سلبي CompBead plus + مضاد للفأر Compbead plus + TRA-1-60 PE 3. تعويض PerCP-Cy™5.5 سلبي CompBead plus + مضاد للفأر Compbead plus + CD13 PerCP-Cy™5.5 4. تعويض Alexa Fluor® 647 سلبي CompBead plus + مضاد للفأر Compbead plus + SSEA-4 Alexa Fluor® 647 4. خلايا فقط لا شيء 5. عنصر تحكم متماثل Ms IgGM PE + Ms IgG1 PerCP-Cy5.5 + Ms IgG3 Alexa Fluor® 647 6. فرز العينة اختباران (10 ميكرولتر) لكل منهما من TRA-1-60 PE + CD13 PerCP-Cy5.5 + SSEA-4 Alexa Fluor® 647 (6) أضف 50-100 ميكرولتر من الخلايا إلى الأنبوبين 4 و5. (7) أضف ما يصل إلى 500 ميكرولتر من الخلايا (5 ملايين خلية) إلى الأنبوب 6. (8) إذا كنت ترغب في فرز أكثر من 5 ملايين خلية، فننصحك بتكرار الأنبوب 6 مع إضافة المزيد من الخلايا التي ترغب في فرزها. (9) حضّن الخلايا على الجليد في الظلام لمدة 20-30 دقيقة. (10) اغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام 2 مل من محلول الفرز المناسب (الأنابيب 4-6). يمكن غسل أنابيب التعويض 1-4 بمحلول PBS معقم بتركيز 1X. (11) أعد تعليق الخلايا في محلول الفرز المناسب (استخدمنا HBSS/4%FBS/10 مليمولار HEPES/1X Pen/Strep/10 ميكرومولار Thiazovivin) بتركيز يتراوح من 2.5 إلى 5 ملايين خلية/مل. بدلاً من ذلك، يُرجى التواصل مع مُشغّل جهاز فرز الخلايا للحصول على التركيز النهائي المُقترح للخلايا. اعتبارات مجموعة الفرز: اختيار إنزيم فصل الخلايا: يُنصح الباحثون باستخدام محلول Accutase™ لفصل الخلايا (رقم المنتج 561527)، حيث لوحظ أن موت الخلايا مع هذه الطريقة ضئيل للغاية. اعتبارات فرز الخلايا المُنشّطة بالفلورة (الخلايا المفردة والخلايا الجماعية): باستخدام اللوحة، تم فرز الخلايا جماعيًا في المراحل المُبكرة والمُتأخرة من إعادة البرمجة (حوالي اليومين 20 و30 بعد النقل الجيني)، وتم فرز الخلايا المفردة في اليوم 30 تقريبًا بعد النقل الجيني. لمزيد من التفاصيل حول سير العمل ومفهوم فرز الخلايا المفردة من الخلايا الجذعية المُستحثة متعددة القدرات (hiPSC)، يُرجى مراجعة Valamehr et al, 2012. لفرز الخلايا المفردة، يُوصى بزراعة الخلايا في أطباق 96 بئرًا بأعداد مختلفة (لقد نجحنا بزراعة 1 و3 و9 خلايا لكل بئر) نظرًا لاختلاف كفاءة الزراعة. تجدر الإشارة إلى أنه في الخلايا المُعاد برمجتها والمُنمّاة في وسط SMC4، يُمكن أن يكون استخدام الفيبرونيكتين (رقم المنتج 356008) بتركيز 5 ميكروغرام/مل مفيدًا لفرز الخلايا، سواءً كانت خلايا منفردة أو ضمن مجموعات، عند حفظه في الوسط لمدة 48 ساعة تقريبًا بعد الفرز. إضافةً إلى ذلك، إذا كانت الخلايا المزروعة في أطباق 96 بئرًا بحاجة إلى النمو على نفس الوسط لأكثر من أسبوع، يُمكن إضافة الفيبرونيكتين بتركيز 5 ميكروغرام/مل للمساعدة في الحفاظ على التصاق الخلايا. تحليل البيانات: يُوصى باتباع نهج التجميع العنقودي عند تحليل البيانات.
إشعارات المنتج: يُرجى مراعاة الاحتياطات التالية: قد يؤدي امتصاص الضوء المرئي إلى تغيير كبير في نقل الطاقة في أي مُقترن فلوري مزدوج؛ لذا، نوصي باتخاذ احتياطات خاصة (مثل تغليف القوارير أو الأنابيب أو الحوامل بورق الألومنيوم) لمنع تعريض الكواشف المُقترنة، بما في ذلك الخلايا المصبوغة بهذه الكواشف، لإضاءة الغرفة. يتم جمع انبعاث فلوروكروم Alexa Fluor® 647 بنفس إعدادات الجهاز المستخدمة مع الألوفيوكوسيانين (APC). Alexa Fluor® هي علامة تجارية مسجلة لشركة Molecular Probes, Inc.، يوجين، أوريغون. تُباع مُقترنات الأجسام المضادة المصبوغة بصبغات Alexa Fluor® و Pacific Blue™ و Cascade Blue® في هذا المنتج بموجب ترخيص من شركة Molecular Probes, Inc. للاستخدام البحثي فقط، باستثناء استخدامها مع المصفوفات الدقيقة، أو ككواشف خاصة بالمادة المُحللة. تخضع أصباغ Alexa Fluor® (باستثناء Alexa Fluor® 430)، وصبغة Pacific Blue™، وصبغة Cascade Blue® لبراءات اختراع قيد الانتظار وصادرة. يمكن استخدام الأجسام المضادة الموسومة بـ PerCP-Cy5.5 مع الكواشف الموسومة بـ FITC وR-PE في أجهزة قياس التدفق الخلوي أحادية الليزر دون تداخل طيفي يُذكر بين تألق PerCP-Cy5.5 وFITC وR-PE. تم تحسين PerCP-Cy5.5 للاستخدام مع ليزر أيون الأرجون الأحادي الذي يُصدر ضوءًا بطول موجي 488 نانومتر. نظرًا لطيف الامتصاص الواسع للفلوروكروم المزدوج، يجب توخي الحذر عند استخدام أجهزة قياس التدفق الخلوي ثنائية الليزر، والتي قد تُثير كلاً من PerCP وCy5.5™ بشكل مباشر. نوصي باستخدام تعويض الحزمة المتقاطعة أثناء جمع البيانات أو التعويض البرمجي أثناء تحليل البيانات. Cy هي علامة تجارية مسجلة لشركة Amersham Biosciences Limited. يُباع هذا المنتج المُقترن بموجب ترخيص من براءات الاختراع الأمريكية التالية: 5,486,616؛ 5,569,587؛ 5,569,766؛ 5,627,027. يخضع هذا المنتج لحقوق الملكية الفكرية لشركة Amersham Biosciences Corp. وجامعة كارنيجي ميلون، ويتم تصنيعه وبيعه بموجب ترخيص من شركة Amersham Biosciences Corp. هذا المنتج مُرخص للبيع لأغراض البحث العلمي فقط، ولا يُرخص لأي استخدام آخر. إذا كنتَ بحاجة إلى ترخيص تجاري لاستخدام هذا المنتج ولم يكن لديك ترخيص، فيُرجى إعادة هذه المادة غير مفتوحة إلى BD Biosciences، 10975 Torreyana Rd، سان دييغو، كاليفورنيا 92121، وسيتم رد أي مبلغ مدفوع مقابلها. مصدر جميع بروتينات المصل هو مسالخ معتمدة من وزارة الزراعة الأمريكية، وتقع في الولايات المتحدة. تنبيه: ينتج أزيد الصوديوم حمض الهيدرازويك شديد السمية في الظروف الحمضية. خفف مركبات الأزيد بالماء الجاري قبل التخلص منها لتجنب تراكم رواسب قابلة للانفجار في أنابيب الصرف الصحي. للاطلاع على أطياف الفلوركروم وإعدادات الجهاز المناسبة، يُرجى زيارة صفحة قياس التدفق الخلوي متعدد الألوان على موقعنا الإلكتروني www.bdbiosciences.com/colors. للاطلاع على البروتوكولات الفنية، يُرجى زيارة www.bdbiosciences.com/us/s/resources.