BD، 563544، BD Horizon™ PE-CF594 Annexin V

التفاعل: بشري (اختبار مراقبة الجودة)
النمط المتماثل: لا شيء لا شيء
التطبيق: قياس التدفق الخلوي (يتم اختباره بشكل روتيني)
حجم العينة لكل اختبار: 5 ميكرولتر
RRID: AB_2869502
محلول التخزين: محلول مائي منظم يحتوي على BSA و ≤0.09% أزيد الصوديوم.
الوضع التنظيمي: للاستخدام البحثي فقط
التحضير والتخزين: يُحفظ غير مخفف في درجة حرارة 4 درجات مئوية، ويُحفظ بعيداً عن الضوء لفترات طويلة. لا يُجمد.
إجراءات التحليل الموصى بها: يُعدّ BD Horizon PE-CF594 Annexin V مسبارًا حساسًا لتحديد الخلايا الميتة، حيث يرتبط بأسطح الفوسفوليبيدات سالبة الشحنة بألفة أعلى للفوسفاتيديل سيرين (PS) مقارنةً بمعظم الفوسفوليبيدات الأخرى. يعتمد ارتباط PE-CF594 Annexin V على الكالسيوم، لذا يلزم تحديد تركيزات معينة من الكالسيوم والأملاح للحصول على تلوين مثالي، كما هو موضح في بروتوكول تلوين PE-CF594 Annexin V. ينبغي على الباحثين ملاحظة أن تحليل التدفق الخلوي باستخدام PE-CF594 Annexin V على أنواع الخلايا الملتصقة (مثل HeLa وNIH-3T3 وغيرها) لا يُجرى بشكل روتيني، نظرًا لاحتمالية حدوث تلف محدد في الغشاء أثناء فصل الخلايا أو جمعها. مع ذلك، فقد نُشرت سابقًا طرق لاستخدام Annexin V في قياس التدفق الخلوي على أنواع الخلايا الملتصقة (Casiola-Rosen et al. وvan Engelend et al.). تحفيز موت الخلايا المبرمج بواسطة كامبتوثيسين: يُقدَّم البروتوكول التالي كمثال توضيحي لكيفية استخدام PE-CF594 Annexin V على خط خلوي (Jurkat). المواد: 1. تحضير محلول كامبتوثيسين المركز (Sigma-Aldrich Cat. No. C-9911): 1 ملي مولار في DMSO. 2. خلايا Jurkat T (ATCC TIB-152). الإجراء: 1. إضافة كامبتوثيسين (التركيز النهائي 4-6 ميكرومولار) إلى 1 × 10^6 خلية Jurkat. 2. حضانة الخلايا لمدة 4-6 ساعات عند 37 درجة مئوية. 3. اتباع بروتوكول تلوين PE-CF594 Annexin V لقياس موت الخلايا المبرمج. الكواشف: 1. BD Horizon PE-CF594 Annexin V: مُضمَّن. استخدم 5 ميكرولتر لكل اختبار. ٢. ٧-أمينو-أكتينوميسين د (٧-AAD): غير مُضمّن. ٧-AAD (رقم المنتج ٥٥٩٩٢٥) صبغة حمض نووي سهلة الاستخدام وجاهزة للاستخدام، ذات تألق قابل للكشف في نطاق الأشعة تحت الحمراء البعيدة من الطيف. استخدم ٥ ميكرولتر لكل اختبار. ٣. محلول ربط أنيكسين بتركيز ١٠ أضعاف: غير مُضمّن. ٠.١ مولار هيبس (الأس الهيدروجيني ٧.٤)، ١.٤ مولار كلوريد الصوديوم، ٢٥ ملي مولار كلوريد الكالسيوم. يُحفظ في درجة حرارة ٤ درجات مئوية. بدلاً من ذلك، يمكن شراء محلول ربط أنيكسين V من BD Pharmingen™، بتركيز ١٠ أضعاف (رقم المنتج ٥٥٦٤٥٤). بروتوكول تلوين أنيكسين V من BD Horizon PE-CF٥٩٤: التلوين ١. اغسل الخلايا مرتين بمحلول فوسفات بارد، ثم أعد تعليقها في محلول الربط بتركيز ١× بتركيز ١ × ١٠^٦ خلية/مل. ٢. انقل ١٠٠ ميكرولتر من معلق الخلايا (١ × ١٠^٥ خلية) إلى أنبوب زراعة سعة ٥ مل. ٣. أضف ٥ ميكرولتر من PE-CF594 Annexin V (للتحليل أحادي اللون وثنائي اللون) و٥ ميكرولتر من 7-AAD (للتحليل ثنائي اللون فقط). ٤. رجّ الخلايا برفق باستخدام جهاز الخلط الدوامي، ثم حضّنها لمدة ١٥ دقيقة في درجة حرارة الغرفة (٢٥ درجة مئوية) في الظلام. ٥. أضف ٤٠٠ ميكرولتر من محلول ربط Annexin V بتركيز ١× إلى كل أنبوب. حلل باستخدام قياس التدفق الخلوي خلال ساعة واحدة. الضوابط المقترحة لإعداد قياس التدفق الخلوي: تُستخدم الضوابط التالية لضبط التعويض والأرباع: ١. خلايا غير مصبوغة. ٢. خلايا مصبوغة بـ PE-CF594 Annexin V فقط (بدون 7-AAD). 3. الخلايا المصبوغة بـ 7-AAD فقط (بدون PE-CF594 Annexin V). ضوابط التلوين الأخرى: يجب استخدام سلالة خلوية يسهل تحفيزها على الخضوع للاستماتة للحصول على تلوين تحكم إيجابي باستخدام PE-CF594 Annexin V فقط أو باستخدام PE-CF594 Annexin V و7-AAD. من المهم ملاحظة أن المستوى الأساسي للاستماتة والنخر يختلف اختلافًا كبيرًا داخل المجموعة الخلوية. وبالتالي، حتى في غياب الاستماتة المحفزة، ستحتوي معظم مجموعات الخلايا على نسبة ضئيلة من الخلايا التي تكون إيجابية للاستماتة (PE-CF594 Annexin V إيجابي، 7-AAD سلبي أو PE-CF594 Annexin V إيجابي، 7-AAD إيجابي). تُستخدم المجموعة غير المعالجة لتحديد المستوى الأساسي للخلايا الميتة والمستميتة. تُحدد نسبة الخلايا التي حُثّت على الخضوع للاستماتة عن طريق طرح نسبة الخلايا المستميتة في المجموعة غير المعالجة من نسبة الخلايا المستميتة في المجموعة المعالجة. وبما أن موت الخلايا هو النتيجة النهائية للاستماتة، فإن الخلايا في المراحل المتأخرة من الاستماتة ستكون ذات غشاء متضرر وستُظهر تفاعلًا إيجابيًا مع كلٍ من 7-AAD وPE-CF594 Annexin V. وبالتالي، لا يُميّز هذا الاختبار بين الخلايا التي خضعت بالفعل للاستماتة وتلك التي ماتت نتيجةً لمسار النخر، لأن الخلايا الميتة في كلتا الحالتين ستُظهر تفاعلًا إيجابيًا مع كلٍ من PE-CF594 Annexin V و7-AAD.
ملاحظات المنتج: تم تخفيف هذا الكاشف مسبقًا للاستخدام بالحجم الموصى به لكل اختبار. نستخدم عادةً 1 × 10^6 خلية في عينة تجريبية حجمها 100 ميكرولتر (اختبار). تحذير: ينتج أزيد الصوديوم حمض الهيدرازويك شديد السمية في الظروف الحمضية. خفف مركبات الأزيد بالماء الجاري قبل التخلص منها لتجنب تراكم رواسب قابلة للانفجار في أنابيب الصرف الصحي. مصدر جميع بروتينات المصل هو مسالخ معتمدة من وزارة الزراعة الأمريكية تقع في الولايات المتحدة. يرجى مراعاة الاحتياطات التالية: يمكن أن يؤدي امتصاص الضوء المرئي إلى تغيير كبير في نقل الطاقة الذي يحدث في أي مركب فلوري مزدوج؛ لذلك، نوصي باتخاذ احتياطات خاصة (مثل تغليف القوارير أو الأنابيب أو الحوامل بورق الألومنيوم) لمنع تعرض الكواشف المقترنة، بما في ذلك الخلايا المصبوغة بهذه الكواشف، لإضاءة الغرفة. عند إثارته بواسطة ليزر أصفر-أخضر (561 نانومتر)، قد يكون التألق أكثر سطوعًا مما هو عليه عند إثارته بواسطة ليزر أزرق (488 نانومتر). نظرًا لطيف الامتصاص الواسع للفلوروكروم المزدوج، يجب توخي الحذر الشديد عند استخدام أجهزة قياس التدفق الخلوي متعددة الليزر، والتي قد تُثير كلاً من PE وCF™594 بشكل مباشر. يُقدَّم هذا المنتج بموجب اتفاقية بين شركتي BIOTIUM وBD Biosciences. يخضع تصنيع هذا المنتج أو استخدامه أو بيعه أو عرضه للبيع أو استيراده لبراءة اختراع واحدة أو أكثر أو طلبات براءات اختراع قيد الانتظار مملوكة أو مرخصة لشركة Biotium, Inc. يُسمح باستخدام هذا المنتج، وبالكمية التي اشتراها المشتري فقط، لأغراض البحث الداخلي الخاص بالمشتري، بما يتوافق مع كتيب المنتج المرفق. لا يُمنح أي حق آخر في استخدام أو بيع أو نقل (أ) هذا المنتج، أو (ب) مكوناته، صراحةً أو ضمنًا أو بموجب مبدأ الإغلاق القضائي. هذا المنتج مخصص للاستخدام البحثي فقط. تتطلب الاستخدامات التشخيصية ترخيصًا منفصلاً من شركة Biotium, Inc. للحصول على معلومات حول شراء ترخيص لهذا المنتج، بما في ذلك لأغراض أخرى غير البحث، يُرجى التواصل مع شركة Biotium, Inc.، 3159 Corporate Place، Hayward، CA 94545، هاتف: (510) 265-1027، فاكس: (510) 265-1352، بريد إلكتروني: btinfo@biotium.com. Texas Red هي علامة تجارية مسجلة لشركة Molecular Probes, Inc.، Eugene، OR. CF™ هي علامة تجارية لشركة Biotium, Inc. للاطلاع على أطياف الفلوركروم وإعدادات الجهاز المناسبة، يُرجى زيارة صفحة قياس التدفق الخلوي متعدد الألوان على موقعنا الإلكتروني www.bdbiosciences.com/colors. للاطلاع على البروتوكولات الفنية، يُرجى زيارة www.bdbiosciences.com/us/s/resources.