BD، 563974، BD Horizon™ BV605 Annexin V

التفاعل: بشري (اختبار مراقبة الجودة)
النمط المتماثل: لا شيء لا شيء
التطبيق: قياس التدفق الخلوي (يتم اختباره بشكل روتيني)
حجم العينة لكل اختبار: 5 ميكرولتر
RRID: AB_2869539
محلول التخزين: محلول مائي منظم يحتوي على BSA و ≤0.09% أزيد الصوديوم.
الوضع التنظيمي: للاستخدام البحثي فقط
التحضير والتخزين: يُحفظ غير مخفف في درجة حرارة 4 درجات مئوية، ويُحفظ بعيداً عن الضوء لفترات طويلة. لا يُجمد.
إجراءات التحليل الموصى بها: يُعدّ BD Horizon BV605 Annexin V مسبارًا حساسًا لتحديد الخلايا الميتة، حيث يرتبط بأسطح الفوسفوليبيدات سالبة الشحنة بألفة أعلى للفوسفاتيديل سيرين (PS) مقارنةً بمعظم الفوسفوليبيدات الأخرى. يعتمد ارتباط BV605 Annexin V على الكالسيوم، لذا يلزم وجود تركيزات محددة من الكالسيوم والأملاح للحصول على تلوين مثالي، كما هو موضح في بروتوكول تلوين BV605 Annexin V. ينبغي على الباحثين ملاحظة أن تحليل التدفق الخلوي باستخدام BV605 Annexin V على أنواع الخلايا الملتصقة (مثل HeLa وNIH-3T3 وغيرها) لا يُجرى بشكل روتيني، نظرًا لاحتمالية حدوث تلف محدد في الغشاء أثناء فصل الخلايا أو جمعها. مع ذلك، فقد نُشرت سابقًا طرق لاستخدام Annexin V في قياس التدفق الخلوي على أنواع الخلايا الملتصقة (Casiola-Rosen et al. وvan Engelend et al.). للحصول على نتائج مثالية وقابلة للتكرار، يُنصح باستخدام محلول التلوين BD Horizon Brilliant Stain Buffer عند استخدام صبغتين أو أكثر من صبغات BD Horizon Brilliant في التجربة نفسها. قد تتسبب تفاعلات الصبغات الفلورية في ظهور شوائب في التلوين، مما قد يؤثر على تفسير البيانات. صُمم محلول التلوين BD Horizon Brilliant Stain Buffer لتقليل هذه التفاعلات. يمكنكم الاطلاع على المزيد من المعلومات في ورقة البيانات الفنية الخاصة بمحلول التلوين BD Horizon Brilliant Stain Buffer (رقم المنتج 563794). تحفيز موت الخلايا المبرمج بواسطة كامبتوثيسين: يُقدم البروتوكول التالي كمثال توضيحي لكيفية استخدام BV605 Annexin V على خط خلوي (Jurkat). المواد: 1. تحضير محلول كامبتوثيسين المركز (Sigma-Aldrich، رقم المنتج C-9911): 1 ملي مولار في ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO). 2. خلايا Jurkat T (ATCC TIB-152). الإجراء: 1. أضف كامبتوثيسين (بتركيز نهائي 4-6 ميكرومتر) إلى 1 × 10^6 خلية جركات. 2. حضّن الخلايا لمدة 4-6 ساعات عند 37 درجة مئوية. 3. اتبع بروتوكول تلوين Annexin V BV605 لقياس موت الخلايا المبرمج. الكواشف: 1. BD Horizon BV605 Annexin V: مُضمّن. استخدم 5 ميكرولتر لكل اختبار. 2. 7-أمينو-أكتينوميسين د (7-AAD): غير مُضمّن. 7-AAD (رقم المنتج 559925) صبغة حمض نووي سهلة الاستخدام وجاهزة للاستخدام، ذات تألق قابل للكشف في نطاق الأشعة تحت الحمراء البعيدة من الطيف. استخدم 5 ميكرولتر لكل اختبار. 3. محلول ربط Annexin بتركيز 10X: غير مُضمّن. 0.1 مولار هيبس (الأس الهيدروجيني 7.4)، 1.4 مولار كلوريد الصوديوم، 25 ملي مولار كلوريد الكالسيوم. يُحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية. بدلاً من ذلك، يمكن شراء محلول ربط أنيكسين V من BD Pharmingen™، بتركيز 10X (رقم المنتج 556454). بروتوكول تلوين أنيكسين V من BD Horizon BV605: التلوين: 1. اغسل الخلايا مرتين بمحلول فوسفات بارد، ثم أعد تعليقها في محلول الربط بتركيز 1× بتركيز 1 × 10^6 خلية/مل. 2. انقل 100 ميكرولتر من معلق الخلايا (1 × 10^5 خلية) إلى أنبوب زراعة سعة 5 مل. 3. أضف 5 ميكرولتر من أنيكسين V BV605 (للتحليل أحادي اللون وثنائي اللون) و5 ميكرولتر من 7-AAD (للتحليل ثنائي اللون فقط). ٤. رجّ الخلايا برفق باستخدام جهاز الخلط الدوامي، ثم حضّنها لمدة ١٥ دقيقة في درجة حرارة الغرفة (٢٥ درجة مئوية) في الظلام. ٥. أضف ٤٠٠ ميكرولتر من محلول ربط Annexin V بتركيز ١× إلى كل أنبوب. حلل النتائج باستخدام قياس التدفق الخلوي خلال ساعة واحدة. الضوابط المقترحة لإعداد قياس التدفق الخلوي: تُستخدم الضوابط التالية لضبط التعويض والأرباع: ١. خلايا غير مصبوغة. ٢. خلايا مصبوغة بـ BV605 Annexin V فقط (بدون 7-AAD). ٣. خلايا مصبوغة بـ 7-AAD فقط (بدون BV605 Annexin V). ضوابط صبغ أخرى: يُنصح باستخدام سلالة خلوية يسهل تحفيزها على الخضوع للاستماتة الخلوية للحصول على صبغ تحكم إيجابي باستخدام BV605 Annexin V فقط أو باستخدام BV605 Annexin V و7-AAD. من المهم ملاحظة أن المستوى الأساسي للاستماتة والنخر يختلف اختلافًا كبيرًا داخل المجموعة الخلوية. لذا، حتى في غياب الاستماتة المُستحثة، تحتوي معظم مجموعات الخلايا على نسبة ضئيلة من الخلايا التي تُظهر علامات الاستماتة (BV605 Annexin V إيجابي، 7-AAD سلبي أو BV605 Annexin V إيجابي، 7-AAD إيجابي). تُستخدم المجموعة الخلوية غير المُعالجة لتحديد المستوى الأساسي للخلايا الميتة والمُستحثة. ثم تُحدد نسبة الخلايا التي تم تحفيزها على الاستماتة بطرح نسبة الخلايا المُستحثة في المجموعة غير المُعالجة من نسبة الخلايا المُستحثة في المجموعة المُعالجة. بما أن موت الخلايا هو النتيجة النهائية لعملية الاستماتة، فإن الخلايا في المراحل المتأخرة من الاستماتة ستكون ذات غشاء تالف وستظهر تفاعلاً إيجابياً مع كل من 7-AAD وBV605 Annexin V. وبالتالي، فإن هذا الفحص لا يميز بين الخلايا التي خضعت بالفعل للاستماتة وتلك التي ماتت نتيجة لمسار النخر، لأنه في كلتا الحالتين ستظهر الخلايا الميتة تفاعلاً إيجابياً مع كل من BV605 Annexin V و7-AAD.
ملاحظات المنتج: تم تخفيف هذا الكاشف مسبقًا للاستخدام بالحجم الموصى به لكل اختبار. نستخدم عادةً 1 × 10^6 خلية في عينة تجريبية بحجم 100 ميكرولتر (اختبار). يُرجى مراعاة الاحتياطات التالية: قد يؤدي امتصاص الضوء المرئي إلى تغيير كبير في نقل الطاقة الذي يحدث في أي مُقترن فلوري مزدوج؛ لذلك، نوصي باتخاذ احتياطات خاصة (مثل تغليف القوارير أو الأنابيب أو الحوامل بورق الألومنيوم) لمنع تعريض الكواشف المُقترنة، بما في ذلك الخلايا المصبوغة بهذه الكواشف، لإضاءة الغرفة. تحذير: ينتج أزيد الصوديوم حمض الهيدرازويك شديد السمية في الظروف الحمضية. خفف مركبات الأزيد في الماء الجاري قبل التخلص منها لتجنب تراكم رواسب قابلة للانفجار في أنابيب الصرف الصحي. مصدر جميع بروتينات المصل هو مسالخ معتمدة من وزارة الزراعة الأمريكية تقع في الولايات المتحدة. رغم بذل قصارى الجهد لتقليل التباين بين دفعات إنتاج الفلوركروم في كفاءة نقل الطاقة، قد تُلاحظ اختلافات في الانبعاث المتبقي من BD Horizon™ BV421. لذا، نوصي بإجراء فحوصات تعويض فردية لكل مُقترن BD Horizon™ BV605. CF™ علامة تجارية مسجلة لشركة Biotium, Inc. للاطلاع على أطياف الفلوركروم وإعدادات الجهاز المناسبة، يُرجى زيارة صفحة قياس التدفق الخلوي متعدد الألوان على موقعنا الإلكتروني www.bdbiosciences.com/colors. للاطلاع على البروتوكولات الفنية، يُرجى زيارة www.bdbiosciences.com/us/s/resources.