BD، 564060، BD Pharmingen™ Calcein Blue AM

التطبيق: قياس التدفق الخلوي (تم اختباره أثناء التطوير)
RRID: AB_2869544
الوضع التنظيمي: للاستخدام البحثي فقط
إجراءات التحليل الموصى بها: التحضير: ضع مسحوق BD Pharmingen™ Calcein Blue AM وثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) طازج من الدرجة المستخدمة في زراعة الخلايا (مثل Sigma، رقم المنتج D2650) في درجة حرارة الغرفة. أضف 430 ميكرولتر من DMSO لتحضير محلول أساسي بتركيز 5 ملي مولار (الكتلة المولية = 465.41 جم/مول) ورجّ المحلول جيدًا. افحص المحلول وكرر الرجّ حتى يذوب الصبغ تمامًا. التخزين: خزّن BD Pharmingen™ Calcein Blue AM في مكان جاف عند درجة حرارة -80 درجة مئوية، بعيدًا عن الضوء حتى الاستخدام. بعد إعادة تكوينه باستخدام DMSO، خزّن المحلول في درجة حرارة -20 درجة مئوية في أجزاء صغيرة. تجنب دورات التجميد والذوبان. تخلص من أجزاء الصبغ بعد 6 أشهر من إعادة تكوينه باستخدام DMSO. ملاحظات • عند تخفيف صبغة BD Pharmingen™ Calcein Blue AM بمحلول مائي، يجب استخدامها فورًا، حيث قد تتحلل هذه الصبغة القابلة للتحلل بواسطة الإستيراز تلقائيًا مع التعرض المطول للماء. • يرجى ملاحظة أن هذه الصبغات قابلة للتحلل بواسطة الإستيراز. قد يحتوي المصل على نشاط إستيراز، وبالتالي قد تقلل المحاليل المنظمة المحتوية على المصل من دقة التمييز بين الخلايا الحية وغير الحية إذا تم استخدامها أثناء التلوين. يمكن استخدام المحاليل المنظمة المحتوية على المصل في خطوات الغسل بعد اكتمال التلوين. • هذه الصبغة غير قابلة للتثبيت. الإجراء العام: 1. تحضير الخلايا للتلوين بالقياس الخلوي التدفق باستخدام محلول منظم خالٍ من المصل (مثل محلول دولبيكو الملحي الفوسفاتي 1X). 2. غسل الخلايا مرة واحدة في محلول منظم خالٍ من المصل. 3. إعادة تعليق الخلايا بتركيز يتراوح بين 1 و10 × 10^6 خلية/مل في الصبغة المخففة في محلول منظم خالٍ من المصل. نوصي بالتلوين بتركيز نهائي قدره 10 ميكرومتر كنقطة بداية للتمييز بين الخلايا الحية والميتة والتطبيقات متعددة الألوان. نظرًا لأن شدة الفلورة قد تختلف باختلاف نوع الخلية والظروف التجريبية، يُنصح بمعايرة الصبغة لتحديد التركيز الأمثل لكل بروتوكول تجريبي. 4. حضّن المزيج لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة بعيدًا عن الضوء. 5. اغسل الخلايا مرتين باستخدام 2 مل من محلول التلوين BD Pharmingen™ (FBS) أو ما يعادله. 6. اسحب السائل الطافي واخلط برفق لتفكيك الخلايا المترسبة. 7. أعد تعليق الخلايا في محلول التلوين (FBS) أو ما يعادله. 8. حلل الخلايا باستخدام قياس التدفق الخلوي أو لوّنها حسب الرغبة للتطبيقات اللاحقة. ملاحظات حول الخلايا الملتصقة: يمكن تلوين الخلايا الملتصقة وهي معلقة أو في مكانها. لتلوين الخلايا الملتصقة وهي معلقة، اتبع "الإجراء العام" الموضح أعلاه بعد فصل الخلايا إلى معلق خلوي أحادي. يُرجى ملاحظة أنه بالنسبة لبعض الخلايا، قد يؤثر الإزالة الأنزيمية من وسط النمو على سلامة غشاء الخلية، مما قد يؤثر على التلوين باستخدام صبغة BD Pharmingen™ Calcein Blue AM. يُنصح بترك الخلايا تتعافى من التفكك الأنزيمي في وسط النمو. قد يختلف وقت التعافي باختلاف نوع الخلية، لذا قد يكون من المفيد اختبار فترات تعافي متعددة في التجارب الأولية. للتلوين الموضعي، نوصي باتباع البروتوكول التالي: 1. إزالة وسط النمو وغسل الخلايا مرة واحدة بمحلول منظم خالٍ من المصل لإزالة أي بقايا من وسط النمو. 2. إضافة الصبغة المخففة في محلول منظم خالٍ من المصل إلى المزرعة. أ. نوصي بالتلوين بتركيز نهائي قدره 10 ميكرومتر كنقطة بداية للتمييز بين الخلايا الحية والميتة والتطبيقات متعددة الألوان. نظرًا لأن درجة السطوع قد تختلف بناءً على نوع الخلية والظروف التجريبية، يُنصح بإجراء معايرة لتحديد التركيز الأمثل لكل بروتوكول تجريبي. 3. حضانة الخليط لمدة 30-60 دقيقة عند 37 درجة مئوية مع حمايته من الضوء. ٤. اغسل المزارع مرتين بمحلول التلوين BD Pharmingen™ (FBS) أو ما يعادله. ٥. أزل الخلايا من وسط النمو. نوصي باستخدام محلول فصل الخلايا BD™ Accutase™. أ. اغسل الخلايا مرتين بمحلول التلوين BD Pharmingen™ (FBS) أو ما يعادله. ب. أعد تعليق الخلايا في محلول التلوين (FBS) أو ما يعادله. ج. حلل الخلايا باستخدام قياس التدفق الخلوي أو لونها حسب الرغبة للتطبيقات اللاحقة.
ملاحظات المنتج: نظرًا لاختلاف التطبيقات، ينبغي على كل باحث معايرة الكاشف للحصول على أفضل النتائج. للاطلاع على أطياف الفلوركروم وإعدادات الجهاز المناسبة، يُرجى زيارة صفحة قياس التدفق الخلوي متعدد الألوان على موقعنا الإلكتروني www.bdbiosciences.com/colors. أكيوتاز علامة تجارية مسجلة لشركة Innovative Cell Technologies, Inc. قبل التلوين بهذا الكاشف، يُرجى التأكد من قدرة جهاز قياس التدفق الخلوي على إثارة الفلوركروم وتمييز الفلورة الناتجة. يُرجى مراجعة www.bdbiosciences.com/us/s/resources للاطلاع على البروتوكولات الفنية.