BD، 565575، مجموعة BD Pharmingen™ لعامل النسخ الفوسفوري

الوضع التنظيمي: للاستخدام البحثي فقط
الوصف: تعتمد المناعة الوقائية على استجابات منسقة بين الخلايا التائية التنظيمية والتقليدية ومجموعات فرعية أخرى من الكريات البيضاء. توفر تحليلات التدفق الخلوي عالية الدقة لاستجابات الإشارات التي تُجريها مجموعات الكريات البيضاء الفرعية، والمحددة بمستويات التعبير المشترك لمستضدات التمايز السطحية وعوامل النسخ المحددة، رؤى معمقة حول الآليات الخلوية والجزيئية التي تقوم عليها تنظيم المناعة في الحالات الصحية والمرضية. تاريخيًا، شكلت خصائص توافق المحاليل المتباينة تحديات أمام التحليل المتزامن لهذه المؤشرات الحيوية المتزامنة. صُممت مجموعة محاليل BD Pharmingen™ Transcription Factor Phospho (TFP) Buffer Set لتمكين التحليل القوي والمتزامن بالتدفق الخلوي لمختلف مستضدات سطح الخلية، وعوامل النسخ، وبروتينات الإشارة المفسفرة في الخلايا المشتقة من أنسجة الإنسان والفأر. ويشمل ذلك خلايا الدم أحادية النواة الطرفية البشرية الطازجة والمثبتة والمجمدة. تم تطبيق مجموعة محاليل BD Pharmingen™ TFP بنجاح في تحليل التدفق الخلوي متعدد المعايير لاستجابات إشارات Stat المفسفرة للسيتوكينات التي تنتجها الخلايا التائية التنظيمية والخلايا التائية التقليدية في الإنسان والفأر، وأنواع أخرى من الكريات البيضاء التي تُحدد بواسطة علامات سطح الخلية وعوامل النسخ (FoxP3 وT-bet) والخصائص الفيزيائية. مع أن توافق جميع الأجسام المضادة غير معروف، إلا أنه من المتوقع أن تكون استجابات إشارات الخلية للمحفزات المختلفة قابلة للتحليل باستخدام هذه المجموعة من المحاليل والأجسام المضادة الخاصة بعلامات سطح الخلية الأخرى وعوامل النسخ وأنواع بروتينات الإشارات المفسفرة اللاحقة. يتوافق نظام المحاليل هذا مع العديد من كواشف BD، بما في ذلك الأجسام المضادة المقترنة بأصباغ فلورية جديدة (مثل BD Horizon™ BV421 وBV510 وPE-CF594 وV450 وV500). محلول تثبيت/مُعزز ثبات اللون 4X TFP - يحتوي على 15.6% فورمالديهايد، 5.5% ميثانول. تحذيرات المخاطر: سائل قابل للاشتعال. ضار عند البلع أو ملامسة الجلد. سام عند الاستنشاق. يُسبب تهيج الجلد. يُسبب تلفًا خطيرًا للعين. قد يُسبب رد فعل تحسسي للجلد. يُشتبه في تسببه بعيوب وراثية. قد يُسبب السرطان. طريقة التعرض: الاستنشاق. قد يُسبب تلفًا للجهاز العصبي المركزي. طريقة التعرض: الفم. قد يُسبب تهيجًا في الجهاز التنفسي. احتياطات السلامة: ارتدِ قفازات واقية/واقي للعينين. ارتدِ ملابس واقية. لا تستنشق الرذاذ/الأبخرة/البخاخ. في حالة ملامسة العينين: اشطفهما بحذر بالماء لعدة دقائق. أزل العدسات اللاصقة، إن وجدت ويسهل إزالتها. استمر في الشطف. في حالة الاستنشاق: انقل المصاب إلى الهواء الطلق وأبقِه في وضع مريح للتنفس. في حالة الابتلاع: اتصل بمركز السموم/الطبيب إذا شعرت بتوعك. محلول بيرم بافر III - يحتوي على 88% ميثانول. بيانات المخاطر: سائل وبخار شديد الاشتعال. سام عند الابتلاع أو ملامسة الجلد أو الاستنشاق. يسبب تلفًا للجهاز العصبي المركزي. طريقة التعرض: عن طريق الفم. بيانات الاحتياطات: يُحفظ بعيدًا عن الحرارة/الشرر/اللهب المكشوف/الأسطح الساخنة. ممنوع التدخين. ارتدِ ملابس واقية/واقي للعينين. ارتدِ قفازات واقية. لا تستنشق الرذاذ/الأبخرة. في حالة ملامسة الجلد (أو الشعر): انزع/اخلع جميع الملابس الملوثة فورًا. اشطف الجلد بالماء/استحم. في حالة الاستنشاق: انقل المصاب إلى الهواء الطلق وأبقِه في وضع مريح للتنفس.
إجراءات الفحص الموصى بها: مخطط بروتوكول إجراءات الفحص الموصى بها 1. معالجة الخلايا: تحضير معلق خلوي أحادي وترسيب الخلايا بالطرد المركزي. إعادة تعليق الخلايا في 50-100 ميكرولتر/اختبار من محلول دولبيكو الفوسفاتي المخفف (PBS) بتركيز 1× المحتوي على الكالسيوم والمغنيسيوم، ثم معالجة الخلايا (مثلًا، باستخدام مُعدِّل استجابة). 2. تثبيت الخلايا ونفاذيتها باستخدام مجموعة محاليل BD Pharmingen™ Transcription Factor Phospho (TFP) (رقم المنتج 563239/565575). 3. غسل الخلايا باستخدام محلول TFP Perm/Wash بتركيز 1×. ترسيب الخلايا بالطرد المركزي وسحب السائل الطافي. لا تترك أي سائل طافي متبقٍ من المحلول. 4. حضانة الخلايا مع محلول BD Phosflow™ Perm III، وترسيب الخلايا، وإزالة السائل الطافي من محلول Perm III. 5. اغسل الخلايا بمحلول TFP Perm/Wash Buffer بتركيز 1×، ثم صبغها بالأجسام المضادة الفلورية. اغسل الخلايا مرة أخرى بمحلول TFP Perm/Wash Buffer بتركيز 1×. 6. أعد تعليق الخلايا في محلول BD Pharmingen™ Stain Buffer (BSA) (رقم المنتج 554657) وحللها باستخدام قياس التدفق الخلوي. ملاحظات عامة: • يُجرى البروتوكول بالكامل عند درجة حرارة تتراوح بين 2 و8 درجات مئوية، باستثناء حالتين: o أثناء معالجة الخلايا الطازجة بمحلول DPBS بتركيز 1× مع مُعدِّل الاستجابة o عند استخدام محلول Perm Buffer III المُخزَّن عند درجة حرارة -20 درجة مئوية. • برِّد جهاز الطرد المركزي، وجهِّز مزيج الأجسام المضادة الفلورية والمحاليل الأخرى قبل بدء البروتوكول. • حضِّر محلول TFP Perm/Wash Buffer بتركيز 1× من محلول TFP Perm/Wash Buffer المركز بتركيز 5× عن طريق تخفيفه بالماء المُرشَّح والمُنقَّى. • حضِّر أيضًا محلول TFP Fix/Perm Buffer بتركيز 1× قبل الاستخدام بـ 10-15 دقيقة. امزج محلول التثبيت/النفاذية TFP المركز 4× مع مخفف TFP بتركيز 0.75× لتحضير محلول النفاذية/الغسل TFP بتركيز 1× (على سبيل المثال، استخدم 10 مل من محلول التثبيت/النفاذية TFP المركز 4× وامزجه مع 30 مل من مخفف TFP بتركيز 0.75×). • يمكن تقليل الفترة الزمنية لتلوين الخلايا بالأجسام المضادة إلى 30 دقيقة. مع ذلك، تم تطوير بروتوكول التلوين الأصلي باستخدام فترات حضانة لا تقل عن 40 دقيقة. • حافظ على درجة حرارة جهاز الطرد المركزي بين 2 و8 درجات مئوية، وحافظ على سرعة الطرد المركزي ثابتة (380 جم قبل تثبيت الخلايا، و500 جم بعد التثبيت). • لا يتطلب استخدام محلول النفاذية/الغسل أي فترة حضانة للنفاذية. هذا غير ضروري. • هذا البروتوكول غير مُحسَّن للاستخدام مع الدم الكامل. المواد والمعدات • محلول دولبيكو الفوسفاتي الملحي (DPBS) بتركيز 1× يحتوي على الكالسيوم والمغنيسيوم • محلول دولبيكو الفوسفاتي الملحي (DPBS) بتركيز 1× لا يحتوي على الكالسيوم والمغنيسيوم • مجموعة محلول فوسفات عامل النسخ BD Pharmingen™ (رقم المنتج 563239/565575) • محلول تلوين BD Pharmingen™ (BSA) (رقم المنتج 554657) • أنابيب طرد مركزي مخروطية معقمة من البولي بروبيلين سعة 50 أو 15 مل • حاضنة أو حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية • جهاز طرد مركزي مضبوط الحرارة قادر على الطرد المركزي بقوة 200-600 غرام، ويتسع لأنابيب قياس التدفق الخلوي، وألواح 96 بئراً عميقة، وأنابيب مخروطية سعة 15 و50 مل • العينات: خلايا الدم أحادية النواة الطرفية (PBMC) من 1 إلى 2 مليون خلية لكل اختبار للمعالجة بالجملة وأنابيب قياس التدفق الخلوي. خلايا الدم المحيطية أحادية النواة (PBMC) من 0.75 إلى 1.0 مليون خلية لكل اختبار للفحص عالي الإنتاجية (HTS) في صفائح الآبار العميقة وصفائح 96 بئرًا ذات قاع مستدير للفحص عالي الإنتاجية على جهاز قياس التدفق الخلوي • مصل بقري جنيني مُعطل حراريًا مع محلول تجميد DMSO بنسبة 7.5% • أنابيب قياس التدفق الخلوي أو صفيحة تخزين سعة 2.2 مل، MARK II (96 بئرًا عميقًا؛ Abgene Cat. No. AB0932) وصفائح زراعة الأنسجة ذات 96 بئرًا • أجسام مضادة فلورية خاصة بالمستضدات داخل الخلايا وعلى سطحها • ماصات متعددة القنوات يمكنها توصيل أحجام 20 ميكرولتر أو 200 ميكرولتر أو 1000 ميكرولتر. تلوين الخلايا في الأنابيب: 1. عالج مستحضرات الخلايا (بشرية أو فأرية) بمعدل استجابة، مثل السيتوكين، بجرعات دون المثلى أو مشبعة (مثل 50-100 وحدة لكل مل) من النوع المطلوب، باستخدام معلق حجمه 1 مل يحتوي على 10-20 مليون خلية (10 الاختبارات) في محلول DPBS بتركيز 1× مع الكالسيوم/المغنيسيوم. ملاحظة: حافظ على حجم محلول DPBS منخفضًا، فهذا مهم للتأثير المطلوب لمحلول التثبيت/النفاذية TFP بتركيز 1×. استخدم أنبوب طرد مركزي مخروطي من البولي بروبيلين سعة 50 مل لمعالجة الخلايا بكميات كبيرة. 2. حضّن لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية، أو استخدم ظروف معالجة محددة أخرى حسب الرغبة. 3. أوقف معالجة الخلايا بإضافة محلول التثبيت/النفاذية TFP بتركيز 1× إلى الخلايا. ملاحظة: أضف 10 مل من محلول التثبيت/النفاذية TFP بتركيز 1× ببطء (عند درجة حرارة 2-8 درجة مئوية). أغلق الأنابيب واقلبها عدة مرات. 4. حضّن لمدة 50 دقيقة عند درجة حرارة 2-8 درجة مئوية لتثبيت الخلايا وزيادة نفاذيتها. 5. أضف 5 مل من محلول النفاذية/الغسل TFP بتركيز 1×. ٦. تُفصل الخلايا بالطرد المركزي عند ٥٠٠ غرام (لمدة ١٥ دقيقة عند درجة حرارة ٢-٨ درجة مئوية). ٧. يُشفط السائل الطافي بعيدًا عن عينات الخلايا المترسبة، وتُغسل الخلايا مرة واحدة بـ ١٠ مل من محلول TFP Perm/Wash Buffer بتركيز ١×. ٨. تُفصل الخلايا بالطرد المركزي عند ٥٠٠ غرام (لمدة ١٠ دقائق)؛ ويُشفط كل السائل الطافي المتبقي بعيدًا عن الخلايا المترسبة. خيار التخزين طويل الأمد: بعد الخطوة ٨، يمكن إعادة تعليق الخلايا في ٢٠٠-٥٠٠ ميكرولتر من مصل بقري جنيني مع ٧.٥٪ من ثنائي ميثيل سلفوكسيد وتجميدها عند -٨٠ درجة مئوية في أنابيب التجميد. تُذاب الخلايا بإخراجها من المُجمد، وإضافة كميات متساوية من محلول TFP Perm/Wash Buffer البارد، ثم إذابتها في حمام مائي بارد. اغسل مرة واحدة بمحلول غسل/نفاذية TFP، ثم تابع البروتوكول بدءًا من الخطوة 9. 9. أضف 1.0 مل من محلول النفاذية III (أو الحجم المطلوب في حال التعامل مع كميات كبيرة) لكل 1-2 مليون خلية. ملاحظات: 1) يُؤخذ محلول النفاذية III من مُجمد بدرجة حرارة -20 درجة مئوية. 2) تصبح كريات الخلايا شفافة خلال هذه الخطوة. 10. حضّن لمدة 20 دقيقة على الجليد للسماح بظهور مُحددات البروتين المُفسفرة. خيار التخزين قصير المدى رقم 2: خزّن طوال الليل عند درجة حرارة 20 درجة مئوية. غطِّ الأنابيب بغشاء بارافين® واحفظها بعيدًا عن الرطوبة. تابع البروتوكول في اليوم التالي. في حال اختيار تخزين العينات بهذه الطريقة، انقلها إلى درجة حرارة 2-8 درجة مئوية واتركها لتدفأ لمدة 5-10 دقائق ثم انتقل إلى الخطوة 11. 11. قم بالطرد المركزي عند 500 غرام (لمدة 8 دقائق، عند درجة حرارة 2-8 درجة مئوية) واسحب محلول النفاذية III بحرص مع التأكد من إزالة كل الحجم المتبقي. ١٢. اغسل مرة واحدة بمحلول TFP Perm/Wash Buffer بتركيز ١×. استخدم ١٠ مل عند استخدام أنابيب مخروطية سعة ٥٠ مل في حالة العينات الكبيرة، أو ٢ مل عند استخدام أنابيب قياس التدفق الخلوي. أزل جميع بقايا المحلول من راسب الخلايا بعد الطرد المركزي. أضف ٨٠-٩٠ ميكرولتر من محلول TFP Perm/Wash Buffer بتركيز ١× لكل اختبار، وأعد تعليق كريات الخلايا استعدادًا للتلوين. اختياري: كرر خطوة الغسل للتأكد من إزالة جميع بقايا محلول Perm Buffer III. قد يؤدي عدم غسل الميثانول جيدًا قبل التلوين إلى تلف البروتينات الفلورية والأصباغ المزدوجة (مثل PerCP وPE وPE-Cy™7). ١٣. التلوين بالأجسام المضادة الفلورية: في هذه المرحلة، قد يكون من الضروري أو المستحسن تقسيم عينات الخلايا إلى أجزاء في أنابيب قياس التدفق الخلوي لتلوينها بمجموعات مختلفة من الأجسام المضادة الفلورية. التلوين داخل الخلايا: أضف أجسامًا مضادة نوعية لمستضدات الهدف داخل الخلايا، مثل FoxP3 وT-bet وبروتينات Stat المُفسفرة، أو جزيئات أخرى داخل الخلايا حسب الرغبة. ملاحظة: من المعروف أنه عند تلوين الخلايا في محلول TFP Perm/Wash Buffer، يلزم استخدام تراكيز أقل من الأجسام المضادة للتلوين داخل الخلايا، على سبيل المثال، 0.5× أو 0.25× حجم الاختبار (عادةً 2.5 ميكرولتر من حجم اختبار 5 ميكرولتر). مع ذلك، يجب استخدام الأجسام المضادة الفلورية النوعية لبروتينات Stat المُفسفرة بالحجم المحدد على العبوة. ملاحظة: عند تلوين FoxP3 البشري، يُوصى باستخدام الجسم المضاد من السلالة 236A للحصول على أفضل النتائج. ب. تلوين جزيئات السطح: حضّر مزيجًا من الأجسام المضادة الفلورية النوعية لتلوين مستضدات سطح الخلية في محلول TFP Perm/Wash Buffer بتركيز 1× أو محلول التلوين (BSA). على سبيل المثال، خفف الأجسام المضادة السطحية الفلورية بنسبة 10 ميكرولتر: 1000 ميكرولتر لتحضير مزيج من 50 اختبارًا، كل اختبار بحجم 20 ميكرولتر. 14. حضّن المزيج لمدة 40-50 دقيقة عند درجة حرارة 2-8 درجة مئوية. 15. اغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام 2 مل من محلول TFP Perm/Wash Buffer بتركيز 1×، ثم قم بطرد معلقات الخلايا بالطرد المركزي عند 500 غرام لمدة 5 دقائق عند درجة حرارة 2-8 درجة مئوية، واسحب السائل الطافي بعيدًا عن الخلايا المترسبة. 16. أعد تعليق الخلايا في 350 ميكرولتر من محلول التلوين (رقم المنتج 554657). ملاحظة: لا تقم بإعادة تعليق الخلايا في محلول TFP Perm/Wash Buffer بتركيز 1×! ١٧. احصل على عدد كافٍ من الأحداث باستخدام قياس التدفق الخلوي للحصول على نتائج ذات دلالة إحصائية، على سبيل المثال، ≥ ١٥٠٠٠ حدث CD4+ أو ≥ ١٥٠ حدث FoxP3+، حسب الحالة. نظرًا لإجراءات التثبيت والنفاذية، قد تختلف إشارات تشتت الضوء الأمامي والجانبي قليلاً عن تلك الخاصة بالخلايا الحية. تلوين الخلايا في صفائح ٩٦ بئرًا: استخدم صفيحة تخزين سعة ٢٫٢ مل، MARK II (٩٦ بئرًا عميقًا؛ Abgene Cat. No. AB0932) وصفائح زراعة الأنسجة ذات ٩٦ بئرًا. ١. عالج مستحضرات الخلايا (بشرية أو فأرية) بمعدلات الاستجابة (كما هو مذكور أعلاه) في صفيحة ٩٦ بئرًا عميقًا باستخدام خلايا بتركيز ٠٫٥-١٫٠ مليون خلية/بئر في محلول DPBS بتركيز ١× مع Ca++/Mg++. على سبيل المثال: ابدأ بـ 50 ميكرولتر من الخلايا بتركيز 10-20 مليون خلية/مل (0.5-1 مليون خلية/بئر)، وأضف 20 ميكرولتر من مُعدِّل الاستجابة (مُخفَّف في محلول DPBS + 1 ملغم/مل من BSA)، ليصبح الحجم النهائي للخلايا مع مُعدِّل الاستجابة 70 ميكرولتر. 2. حضِّن لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية، أو استخدم ظروف معالجة أخرى حسب الرغبة. 3. أوقف معالجة الخلايا بإضافة محلول TFP Fix/Perm Buffer بتركيز 1× إلى الخلايا. استخدم ماصة متعددة القنوات سعة 1.2 مل لإضافة 1.0 مل من محلول TFP Fix/Perm Buffer البارد بتركيز 1×. امزج جيدًا عن طريق السحب والضخ عدة مرات. 4. حضِّن لمدة 50 دقيقة عند درجة حرارة 2-8 درجة مئوية لتثبيت الخلايا وزيادة نفاذيتها. 5. أضف 350 ميكرولتر من محلول TFP Perm/Wash Buffer بتركيز 1× إلى كل بئر. ٦. تُفصل الخلايا بالطرد المركزي عند ٥٠٠ غرام لمدة ٨ دقائق عند درجة حرارة ٢-٨ درجة مئوية. ٧. يُشفط السائل الطافي من العينات وتُغسل الخلايا مرة واحدة بـ ٧٠٠ ميكرولتر من محلول TFP Perm/Wash Buffer بتركيز ١×. ٨. تُفصل الخلايا بالطرد المركزي عند ٥٠٠ غرام لمدة ٨ دقائق ويُشفط كل السائل الطافي المتبقي بعيدًا عن الخلايا المترسبة. خيار التخزين طويل الأمد: بعد الخطوة ٨، تُعلق الخلايا في كل بئر مع ٢٠٠-٥٠٠ ميكرولتر من مصل بقري جنيني (FBS) مع ٧.٥٪ ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) وتُجمد عند -٨٠ درجة مئوية. تُذاب الخلايا بإخراجها من المُجمد، وإضافة ١ مل من محلول TFP Perm/Wash Buffer البارد، ثم تُذاب الصفيحة في حمام مائي بارد. تُغسل الخلايا بمحلول TFP Perm/Wash Buffer مرة إضافية، ثم تُتابع البروتوكول من الخطوة ٩. ٩. قبل إضافة أي محلول منظم إلى الصفيحة، تُرج جيدًا لإعادة تعليق الخلايا. أضف 500 ميكرولتر من محلول Perm Buffer III لكل بئر، ثم استخدم الماصة لخلط المحلول. ملاحظات: 1) يُخرج محلول Perm Buffer III من مُجمد بدرجة حرارة -20 درجة مئوية قبل الاستخدام. 2) تصبح كريات الخلايا شفافة خلال هذه الخطوة. 10. حضّن لمدة 20 دقيقة على الجليد للسماح بظهور الحواتم المُفسفرة. خيار التخزين قصير المدى: خزّن طوال الليل عند درجة حرارة -20 درجة مئوية. غطِّ الطبق بغطاء، وثبّته بشريط Parafilm®، واحفظه بعيدًا عن الرطوبة. تابع البروتوكول في اليوم التالي. إذا اخترت تخزين العينات بهذه الطريقة، أخرج الطبق إلى درجة حرارة 2-8 درجة مئوية واتركه ليدفأ لمدة 5-10 دقائق، ثم انتقل إلى الخطوة 11. 11. افصل الخلايا بالطرد المركزي عند 500 غرام لمدة 8 دقائق عند درجة حرارة 2-8 درجة مئوية، ثم اسحب محلول Perm Buffer III الطافي بعناية بعيدًا عن الخلايا المترسبة. ١٢. اغسل مرة واحدة باستخدام محلول الغسل/النفاذية TFP بتركيز ١×، ١ مل لكل بئر، ثم قم بالطرد المركزي؛ أزل جميع بقايا المحلول. اختياري: كرر خطوة الغسل للتأكد من إزالة جميع بقايا محلول النفاذية III. قد يؤدي عدم غسل الميثانول جيدًا قبل التلوين إلى تلف البروتين الفلوري والأصباغ المزدوجة (مثل PE، PerCP، PE-Cy™7، إلخ). أعد تعليق الخلايا في ١٠٠ ميكرولتر من محلول الغسل/النفاذية TFP بتركيز ١×. ١٣. التلوين بالأجسام المضادة الفلورية: أ. التلوين داخل الخلايا: أضف أجسامًا مضادة خاصة بمستضدات الهدف داخل الخلايا مثل FoxP3، T-bet، بروتينات Stat المفسفرة أو جزيئات أخرى داخل الخلايا حسب الرغبة. ملاحظة: من المعروف أنه عند تلوين الخلايا في محلول TFP Perm/Wash Buffer، يلزم استخدام تركيزات أقل من الأجسام المضادة للتلوين داخل الخلايا، على سبيل المثال، 0.5× أو 0.25× حجم الاختبار (عادةً 2.5 ميكرولتر من حجم اختبار 5 ميكرولتر). مع ذلك، يجب استخدام الأجسام المضادة الفلورية الخاصة ببروتينات Stat المفسفرة بالحجم المحدد على العبوة. ملاحظة: عند تلوين بروتين FoxP3 البشري، يُوصى باستخدام الجسم المضاد من السلالة 236A للحصول على نتائج أفضل. ب. تلوين جزيئات السطح: حضّر مزيجًا من الأجسام المضادة الفلورية الخاصة بتلوين مستضدات سطح الخلية في محلول TFP Perm Wash Buffer أو محلول التلوين (BSA) بتركيز 1×. على سبيل المثال، خفّف الأجسام المضادة الفلورية السطحية بنسبة 10 ميكرولتر: 1000 ميكرولتر لتحضير مزيج من 50 اختبارًا بحجم 20 ميكرولتر لكل اختبار. أضف حجم الاختبار هذا إلى الأنبوب بعد إضافة الأجسام المضادة داخل الخلايا. ١٤. حضّن لمدة ٤٠-٥٠ دقيقة عند درجة حرارة ٢-٨ درجة مئوية. ١٥. اغسل الخلايا مرة أو مرتين باستخدام ٢٠٠ ميكرولتر من محلول غسل/نفاذية TFP، ثم قم بالطرد المركزي عند ٥٠٠ غرام لمدة ٥ دقائق عند درجة حرارة ٢-٨ درجة مئوية؛ اسحب السائل الطافي بعناية. انقل الخلايا إلى صفائح قياسية ذات ٩٦ بئرًا ذات قاع مستدير لتحليلها. ١٦. أعد تعليق الخلايا المترسبة في ٢٠٠ ميكرولتر من محلول التلوين (BSA) (رقم المنتج ٥٥٤٦٥٧). ملاحظة: لا تعيد تعليقها في محلول غسل/نفاذية TFP بتركيز ١×! ١٧. احصل على عدد كافٍ من الأحداث للحصول على نتائج ذات دلالة إحصائية، على سبيل المثال، ١٥٠٠٠ حدث CD4+ أو ١٥٠ حدث FoxP3+ على الأقل، حسب الحالة. تم اختبار الأجسام المضادة على أنها متوافقة مع التلوين باستخدام مجموعة BD Pharmingen™ Transcription Factor Phospho Buffer Set Description Clone Reactivity formats Tested Cat. رقم CD3 SK7 Hu PE 340662 CD3 UCHT1 Hu PerCP-Cy5.5، 560835، 562427، 560365 BD Horizon™ BV421 وV450 CD4 SK3 Hu BV510، PerCP-Cy5.5 562970، 562971، 560650 CD20 HI (FB1) Hu Alexa Fluor® 700 561171 CD21 B-ly4 Hu APC 559867 CD25 2A3, MA251 Hu PE, BD Horizon™ BV421 564033, 557138, 341010, 564033, 562442 CD45RA HI100 Hu بي-سي™7 560675 CD3 17A2 Ms APC-Cy™7، BV421 560590، 564008 CD4 RM4-5 Ms PerCP-Cy5.5 553050 CD25 3C7 Ms BV421 564370 Stat1 (pY701) 4a Hu، Ms Alexa Fluor® 647 612597 Stat3 (pY705) 4/P-STAT3 Hu، Ms Alexa Fluor® 647 557815 Stat4 (pY693) 38/p-Stat4 Hu، Ms Alexa Fluor® 647 558137 Stat5 (pY694) 47/Stat5(pY694) Hu، Ms Alexa Fluor® 647 562076، 612599 Stat6 (pY641) 23/Stat6، 18/P-Stat6 Hu، Ms Alexa Fluor® 647 560000، 612601 CD247، CD3 Zeta (pY142) K25-407.69 Hu Alexa Fluor® 647 558489 ZAP-70 (PY319)/Syk (PY352) 17A/P-ZAP70 Hu Alexa Fluor® 647 557817 SLP-76 (pY128) H3 Hu Alexa Fluor® 647 560057 AKT (pS473) M8961 Hu Alexa Fluor® 647 560343 LAT (pY171) 158-1169 Hu Alexa Fluor® 647 559518 ERK 1/2 (pT202/pY204) 20A Hu Alexa Fluor® 647 561992 Ki-67 B56 Hu Alexa Fluor® 647 561126 FOXP3 259D/C7 Hu Alexa Fluor® 488, PE 560047, 560046 FOXP3 236A/E7 Hu Alexa Fluor® 488، PE 561181، 560852 FOXP3 MF23 السيدة Alexa Fluor® 488، PE 560407، 561181 T-bet O4-46 Hu، Ms PE، PE-CF594 561268، 562467 GATA3 L50-823 Hu PE 560074 EZH2 PE 11/EZH2 هو PE 562478 BMI-1 P51-311 Hu PE 562528 Pax-5 1H9 Hu PE 562688 Fixable Viability Stain 450 N/A Hu BD Horizon™ V450 562247 تم اختبار جميع أشكال الأجسام المضادة المذكورة وثبتت فعاليتها في تلوين الخلايا باستخدام مجموعة BD Pharmingen™ Transcription Factor Phospho Buffer Set. من المحتمل أن يعمل هذا المحلول مع أشكال أخرى من نفس المستنسخات، بالإضافة إلى أجسام مضادة أخرى. مع ذلك، لم يتم اختبارها. إظهار أقل
إشعارات المنتج: يُرجى الرجوع إلى www.bdbiosciences.com/us/s/resources للاطلاع على البروتوكولات الفنية. Alexa Fluor® علامة تجارية مسجلة لشركة Molecular Probes, Inc.، يوجين، أوريغون. مصدر جميع بروتينات المصل هو مسالخ معتمدة من وزارة الزراعة الأمريكية تقع في الولايات المتحدة. تحذير: ينتج أزيد الصوديوم حمض الهيدرازويك شديد السمية في الظروف الحمضية. خفف مركبات الأزيد بالماء الجاري قبل التخلص منها لتجنب تراكم رواسب قابلة للانفجار في أنابيب الصرف الصحي. Cy علامة تجارية لشركة GE Healthcare. إظهار أقل
الوصف: الكمية/الحجم: رقم القطعة: معرف EntrezGene
غير متوفر : 7.5 : غير متوفر : غير متوفر