BD, 556405, BD Pharmingen™ APO-BRDU™ Kit

التطبيق: قياس التدفق الخلوي، التلوين داخل الخلايا (قياس التدفق الخلوي) (تم اختباره أثناء التطوير)
الوضع التنظيمي: للاستخدام البحثي فقط
RRID: AB_2869068
الوصف: تُعدّ عملية تفتيت الحمض النووي (DNA) إحدى الخطوات الأخيرة في موت الخلايا المبرمج، وهي عملية تنتج عن تنشيط الإنزيمات النووية الداخلية أثناء برنامج موت الخلايا المبرمج. تعمل هذه الإنزيمات على تحليل بنية الكروماتين عالية الترتيب إلى شظايا يبلغ طولها حوالي 300 كيلوبايت، ثم إلى قطع أصغر من الحمض النووي يبلغ طولها حوالي 50 زوجًا قاعديًا. تعتمد إحدى الطرق الشائعة للكشف عن الحمض النووي المتفتت على تفاعل يحفزه إنزيم TdT خارجي، ويُشار إليه غالبًا باسم "الوسم الطرفي" أو "TUNEL" (وسم نهايات الحمض النووي المكسورة بواسطة إنزيم ناقل ديوكسي نيوكليوتيديل الطرفي dUTP). في اختبار APO-BRDU™، يحفز إنزيم TdT إضافةً مستقلة عن القالب لثلاثي فوسفات ديوكسي يوريدين المبروم (Br-dUTP) إلى نهايات 3'-هيدروكسيل (OH) للحمض النووي المزدوج والمفرد. بعد الإدماج، تُحدد هذه المواقع باستخدام تقنية قياس التدفق الخلوي عن طريق تلوين الخلايا بأجسام مضادة أحادية النسيلة مضادة لـ BrdU موسومة بـ FITC. يُعد اختبار APO-DIRECT™ (رقم المنتج 51-6536KK) طريقةً أحادية الخطوة لوسم فواصل الحمض النووي باستخدام FITC-dUTP، متبوعةً بتحليل قياس التدفق الخلوي. أما مجموعة APO-BRDU™ فهي طريقة تلوين ثنائية اللون لوسم فواصل الحمض النووي والحمض النووي الخلوي الكلي للكشف عن الخلايا الميتة باستخدام قياس التدفق الخلوي. تتوفر كميات كافية من الكواشف لمعالجة 60 معلقًا خلويًا. تحتوي المجموعة على 5 مل من معلقات الخلايا الموجبة و5 مل من معلقات الخلايا السالبة، أي ما يقارب 1 × 10^6 خلية لكل مل في 70% (حجم/حجم) من الإيثانول. الخلايا الضابطة مشتقة من سلالة خلايا ليمفوما بشرية، وقد تم تثبيتها وفقًا لبروتوكول التثبيت الموضح. تتكون مجموعة APO-BRDU™ من جزأين (الجزء أ والجزء ب). يتكون الجزء أ (رقم المنتج 51-6576AK) من: زجاجة واحدة سعة 0.30 مل من الأجسام المضادة أحادية النسيلة المضادة لـ BrdU الموسومة بـ FITC [النمط المتساوي: فأر؛ 1 ميكروغرام/اختبار (يحتوي على 0.05% أزيد الصوديوم)] (رقم المنتج 51-6584AZ) زجاجة واحدة سعة 30 مل من محلول التلوين PI/RNase (5 ميكروغرام/مل، 200 ميكروغرام/مل RNase) [رقم المنتج 51-6585AZ] قارورة واحدة سعة 0.6 مل من محلول التفاعل (يحتوي على حمض الكاكوديليك (ثنائي ميثيل الزرنيخ)) [رقم المنتج 51-6580AZ] زجاجة واحدة سعة 126 مل من محلول الشطف (يحتوي على 0.05% أزيد الصوديوم) [رقم المنتج 51-6583AZ] زجاجة واحدة سعة 120 مل من محلول الغسيل (يحتوي على 0.05% أزيد الصوديوم) [رقم المنتج 51-6579AZ]. يتكون الجزء ب (رقم المنتج 51-6576BK) من: واحد زجاجة سعة 0.48 مل من Br-dUTP (54.7 ميكروغرام/مل) [رقم المنتج 51-6582EZ] زجاجة واحدة سعة 5 مل من خلايا التحكم السلبية [تحتوي على 70% (حجم/حجم) إيثانول] [رقم المنتج 51-6578LZ] زجاجة واحدة سعة 5 مل من خلايا التحكم الإيجابية [تحتوي على 70% (حجم/حجم) إيثانول] [رقم المنتج 51-6577LZ] زجاجة واحدة سعة 0.045 مل من إنزيم TdT [200 ميكروغرام/مل (SA= 100,000 وحدة/ملغ) في محلول جلسرين 50% (حجم/حجم)؛ لا يتجمد عند -20 درجة مئوية] [رقم المنتج 51-6581EZ]
التحضير والتخزين: تتكون مجموعة APO-BRDU™ من جزأين (أ و ب). يُشحن الجزء أ (رقم القطعة 51-6576AK) في درجة حرارة الغرفة، ويجب تخزينه عند 4 درجات مئوية فور وصوله. أما الجزء ب (رقم القطعة 51-6576BK) فيُشحن عند -80 درجة مئوية على ثلج جاف، ويجب تخزينه عند -20 درجة مئوية فور وصوله. وقد أكدت شركة BD Biosciences Pharmingen أن طريقة الشحن هذه كافية للحفاظ على سلامة مكونات المجموعة.
إجراءات الفحص الموصى بها: طرق تثبيت وتلوين وتحليل عينات APO-BRDU™ بروتوكول التثبيت: هذا بروتوكول قياسي يُستخدم في BD Biosciences Pharmingen لاختبار مراقبة جودة مجموعة APO-BRDU™. يُعد تثبيت الخلايا باستخدام البارافورمالدهيد خطوة أساسية في فحص APO-BRDU™. إجراء تثبيت الخلايا التالي هو طريقة مقترحة. قد تؤثر متغيرات مثل مصدر الخلايا وظروف النمو على النتائج. يجب اعتبار ظروف التثبيت المذكورة أدناه بمثابة إرشادات. قد يلزم إجراء تجارب إضافية للحصول على نتائج مماثلة لخلايا التحكم المرفقة بهذه المجموعة. خلايا التحكم الموجبة والسالبة المرفقة في مجموعة APO-BRDU™ مثبتة مسبقًا. 1. تُعلق الخلايا في محلول بارافورمالدهيد بنسبة 1% (وزن/حجم) في محلول ملحي فوسفاتي (PBS) (الأس الهيدروجيني 7.4) بتركيز 1-2 × 10^6 خلية/مل. ٢. ضع معلق الخلايا على الثلج لمدة ٣٠-٦٠ دقيقة. ٣. افصل الخلايا بالطرد المركزي لمدة ٥ دقائق عند ٣٠٠ × جم، ثم تخلص من السائل الطافي. ٤. اغسل الخلايا في ٥ مل من محلول الفوسفات الملحي (PBS)، ثم افصلها بالطرد المركزي. كرر عملية الغسل والطرد المركزي. ٥. أعد تعليق الخلايا في محلول الفوسفات الملحي المتبقي في الأنبوب عن طريق رج الأنبوب برفق. ٦. اضبط تركيز الخلايا إلى ١-٢ × ١٠^٦ خلية/مل في إيثانول بارد بنسبة ٧٠٪ (حجم/حجم). اترك الخلايا لمدة ٣٠ دقيقة على الأقل على الثلج أو في المجمد. انظر الملاحظة أدناه. ٧. خزّن الخلايا في إيثانول بنسبة ٧٠٪ (حجم/حجم) عند درجة حرارة -٢٠ درجة مئوية حتى الاستخدام. يمكن تخزين الخلايا عند درجة حرارة -٢٠ درجة مئوية لعدة أيام قبل الاستخدام. ملاحظة: في بعض الأنظمة البيولوجية، يُعطي تخزين الخلايا عند درجة حرارة -20 درجة مئوية في محلول إيثانول بتركيز 70% (حجم/حجم) لمدة 12-18 ساعة على الأقل قبل تلوينها للكشف عن موت الخلايا المبرمج أفضل النتائج. يمكن تخزين الخلايا عند درجة حرارة -20 درجة مئوية لعدة أشهر قبل استخدامها. بروتوكول التلوين: يصف البروتوكول التالي طريقة قياس موت الخلايا المبرمج في خلايا التحكم الموجبة والسالبة المتوفرة في مجموعة APO-BRDU™. يجب اتباع الإجراء نفسه لقياس موت الخلايا المبرمج في عينات الخلايا التي يقدمها الباحث. 1. أعد تعليق خلايا التحكم الموجبة (51-6577LZ) والسالبة (51-6578LZ) عن طريق تحريك الأنابيب. خذ 1 مل من معلقات خلايا التحكم (حوالي 1 × 10^6 خلية/مل) وضعها في أنابيب طرد مركزي لقياس التدفق الخلوي (12 × 75 مم). قم بتدوير معلقات الخلايا الضابطة لمدة 5 دقائق عند 300 × g، ثم أزل الإيثانول بتركيز 70% (حجم/حجم) بالشفط، مع الحرص على عدم تحريك الخلايا المترسبة. 2. أعد تعليق كل أنبوب من الخلايا الضابطة في 1.0 مل من محلول الغسل (51-6579AZ) لكل أنبوب. قم بالتدوير كما في السابق، ثم أزل السائل الطافي بالشفط. 3. كرر معالجة محلول الغسل (الخطوة 2). 4. أعد تعليق كل أنبوب من كريات الخلايا الضابطة في 50 ميكرولتر من محلول وسم الحمض النووي (المُحضر كما هو موضح أدناه). محلول وسم الحمض النووي 1 اختبار 5 اختبارات 10 اختبارات محلول التفاعل (غطاء أخضر) 10.00 ميكرولتر 50.00 ميكرولتر 100.00 ميكرولتر إنزيم TdT (غطاء أصفر) 0.75 ميكرولتر 3.75 ميكرولتر 7.50 ميكرولتر Br-dUTP (غطاء بنفسجي) 8.00 ميكرولتر 40.00 ميكرولتر 80.00 ميكرولتر ماء مقطر 32.25 ميكرولتر 161.25 ميكرولتر 322.50 ميكرولتر الحجم الكلي 51.00 ميكرولتر 255.00 ميكرولتر 510.00 ميكرولتر *يعتمد الحجم المناسب من محلول وسم الحمض النووي لتحضير عدد متغير من الاختبارات على مضاعفات أحجام المكونات اللازمة لاختبار واحد. امزج كمية كافية فقط من محلول وسم الحمض النووي لإكمال عدد الاختبارات المُحضّرة لكل جلسة. يبقى محلول وسم الحمض النووي فعالاً لمدة 24 ساعة تقريبًا عند درجة حرارة 4 درجات مئوية. 5. حضّن الخلايا في محلول وسم الحمض النووي لمدة 60 دقيقة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية في حمام مائي مُتحكّم بدرجة حرارته. رجّ الخلايا كل 15 دقيقة لإعادة تعليقها. ملاحظة: يمكن أيضًا إجراء تفاعل وسم الحمض النووي في درجة حرارة الغرفة طوال الليل للخلايا الضابطة. بالنسبة للعينات الأخرى غير الخلايا الضابطة المُرفقة في المجموعة، قد يلزم تعديل أوقات التحضين عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لفترات أطول أو أقصر حسب متطلبات الخلايا التي يُقدّمها الباحث. 6. في نهاية وقت التحضين، أضف 1.0 مل من محلول الشطف (51-6583AZ) إلى كل أنبوب، ثم قم بتدوير كل أنبوب بالطرد المركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق. أزل السائل الطافي بالشفط. ٧. كرر غسل الخلايا (كما في الخطوة ٦) باستخدام ١.٠ مل من محلول الغسل، ثم قم بالطرد المركزي، وأزل السائل الطافي بالشفط. ٨. أعد تعليق الخلايا المترسبة في ٠.١ مل من محلول تلوين الأجسام المضادة (المُحضر كما هو موضح أدناه). ٩. حضّن الخلايا مع محلول الأجسام المضادة المضادة لـ BrdU والموسومة بـ FITC في الظلام لمدة ٣٠ دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ١٠. أضف ٠.٥ مل من محلول تلوين PI/R Nase (٥١-٦٥٨٥ AZ) إلى الأنبوب الذي يحتوي على ٠.١ مل من محلول تلوين الأجسام المضادة. محلول تلوين الأجسام المضادة 1 اختبار 5 اختبارات 10 اختبارات مضاد BrdU موسوم بـ FITC (غطاء برتقالي) 5.00 ميكرولتر 25.00 ميكرولتر 50.00 ميكرولتر محلول الشطف (غطاء أحمر) 95.00 ميكرولتر 475 ميكرولتر 950.00 ميكرولتر الحجم الكلي 100.00 ميكرولتر 500.00 ميكرولتر 1000 ميكرولتر ملاحظة: إذا كانت كثافة الخلايا منخفضة، قلل كمية محلول تلوين PI/RNase إلى 0.3 مل. 11. حضّن الخلايا في الظلام لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. 12. حلل الخلايا في محلول تلوين PI/RNase باستخدام قياس التدفق الخلوي. حلل الخلايا في غضون 3 ساعات من التلوين للحصول على أفضل النتائج. قد تبدأ الخلايا في التلف إذا تُركت طوال الليل قبل التحليل. تحليل عينات APO-BRDU™ باستخدام قياس التدفق الخلوي: يُجرى هذا التحليل على جهاز قياس التدفق الخلوي المزود بليزر أرجون بطول موجي 488 نانومتر كمصدر للضوء. تُظهر الأشكال من 1 إلى 3 النتائج المتوقعة باستخدام خلايا التحكم الموجبة والسالبة. يُستخدم صبغان: بروبيديوم يوديد (PI؛ الحمض النووي الخلوي الكلي) وFITC (الخلايا الميتة). يتألق PI عند حوالي 623 نانومتر، بينما يتألق FITC عند 520 نانومتر عند إثارته بطول موجي 488 نانومتر. لا حاجة لتعويض التألق. يتم إنشاء شاشتين ثنائيتي المعلمات وشاشتين أحاديتي المعلمة باستخدام برنامج جمع بيانات جهاز قياس التدفق الخلوي. يجب أن تكون شاشة البوابات هي شاشة التمييز القياسية ثنائية المعلمات للحمض النووي المزدوج، حيث يُمثل المحور Y مساحة الحمض النووي، والمحور X عرض الحمض النووي (الشكل 1). من هذه الشاشة، يتم رسم بوابة حول الخلايا غير المتكتلة، ثم يتم إنشاء شاشة البوابات ثنائية المعلمات الثانية. في هذا العرض، يُوضع الحمض النووي (الفلورة الحمراء الخطية) على المحور السيني، وFITC-BrdU (الفلورة الخضراء اللوغاريتمية) على المحور الصادي. يمكن إضافة رسمين بيانيين أحاديي المعلمة، أحدهما للحمض النووي والآخر لـFITC-BrdU، ولكنهما ليسا ضروريين. باستخدام طريقة العرض ثنائية المعلمة، لا يتم فقط تحديد الخلايا الميتة، بل يتم أيضًا تحديد مرحلة دورة الخلية فيها. نصائح تقنية وأسئلة شائعة: 1. بالنسبة للباحثين الذين يستخدمون خطوط الخلايا الملتصقة، فإن احتمالية موت الخلايا المبرمج في السائل الطافي أعلى من احتمالية موت الخلايا المبرمج في الخلايا الملتصقة. لذا، يُنصح بحفظ الخلايا في السائل الطافي لاستخدامها في التحليل قبل فصل طبقة الخلايا الملتصقة باستخدام التربسين. 2. يُعد تثبيت الخلايا باستخدام مُثبِّت كيميائي مُرتبط بالحمض النووي (مثل البارافورمالديهايد) خطوةً مهمةً في تحليل موت الخلايا المبرمج بهذه الطريقة. قد تفقد الخلايا غير المثبتة أجزاءً صغيرة من الحمض النووي (DNA) غير المثبتة كيميائيًا داخل الخلية قبل خطوات الغسل. قد يضطر الباحث إلى استكشاف طرق تثبيت ونفاذية بديلة للاستفادة الكاملة من أنظمته. 3. يمكن تحضير شريحة سيتوسبين أو شريحة سيتولوجي بالطرد المركزي من عينة APO-BRDU™ بالطريقة التالية: بعد الانتهاء من تلوين الأجسام المضادة المضادة لـ BrdU الموسومة بـ FITC، ولكن قبل المعالجة بـ PI/RNase، ضع قطرة من الخلايا الملونة على شريحة، وقم بتدويرها، ثم افحص العينة تحت مجهر فلوري. 4. لتقليل فقدان الخلايا أثناء التحليل، نوصي باستخدام أنابيب البوليسترين 12 × 75 مم طوال عملية التلوين والتحليل. مع أنواع أخرى من الأنابيب أو البلاستيك (مثل البولي بروبيلين)، قد تتراكم الخلايا على جوانب الأنابيب، مما يؤدي إلى فقدان كبير في عدد الخلايا، بالإضافة إلى تلوين غير فعال للخلايا التي لم تتعرض بالكامل لكواشف التلوين. نوصي أيضًا، بعد خطوات الغسل، بإعادة تعليق الخلايا عن طريق الخلط اللطيف وليس باستخدام الماصة، حيث أن رؤوس الماصات البلاستيكية قد تُساهم في فقدان الخلايا أثناء التحليل. ٥. في بعض الأحيان، يُلاحظ وجود مجموعة من الخلايا ذات كثافة أقل في شاشة عرض المعلمات المزدوجة في قياس التدفق الخلوي. تنشأ هذه المجموعة أثناء تفاعل وسم الحمض النووي (DNA) بحجم ٥٠ ميكرولتر، عندما تلتصق بعض الخلايا بجدار أنبوب الاختبار ولا تتعرض بالكامل لمحلول الوسم. يمكن التغلب على هذه الظاهرة بغسل جميع الخلايا من جدار الأنبوب والتأكد من تعليقها بشكل صحيح في بداية تفاعل الوسم. ٦. في حال ملاحظة كثافة منخفضة لتلوين FITC، حاول زيادة وقت الحضانة أثناء تفاعل وسم الحمض النووي (DNA) بحجم ٥٠ ميكرولتر. قد تتطلب بعض أنظمة الخلايا أوقات وسم تصل إلى ٤ ساعات عند ٣٧ درجة مئوية. ٧. إذا لم تكن معلومات دورة الخلية مطلوبة، فليس من الضروري إضافة محلول تلوين PI/RNase إلى العينات. تحذير: يحتوي محلول التفاعل (المكون 51-6580AZ) على 0.2% من حمض الكاكوديليك (وزن/وزن). بيانات المخاطر: قد يسبب السرطان. بيانات الاحتياطات: احصل على تعليمات خاصة قبل الاستخدام. لا تتعامل مع المنتج حتى تقرأ جميع احتياطات السلامة وتفهمها. ارتدِ ملابس واقية/واقي للعينين. ارتدِ قفازات واقية. في حالة التعرض أو القلق: احصل على استشارة/رعاية طبية. يُحفظ في مكان مغلق. تخلص من المحتويات/العبوة وفقًا للوائح المحلية/الإقليمية/الوطنية/الدولية. خطر: تحتوي خلايا التحكم السلبية (المكون 51-6578LZ) وخلايا التحكم الإيجابية (المكون 51-6577LZ) على 56.0% من الإيثانول (وزن/وزن). بيانات المخاطر: سائل وبخار شديد الاشتعال. يسبب تهيجًا خطيرًا للعين. بيانات الاحتياطات: يُحفظ بعيدًا عن الحرارة/الشرر/اللهب المكشوف/الأسطح الساخنة. ممنوع التدخين. ارتدِ قفازات واقية/ملابس واقية/واقي للعينين/واقي للوجه. في حالة ملامسة الجلد (أو الشعر): انزع/اخلع جميع الملابس الملوثة فورًا. اغسل الجلد بالماء/استحم. في حالة ملامسة العينين: اشطفهما بحذر بالماء لعدة دقائق. أزل العدسات اللاصقة، إن وجدت وكان من السهل إزالتها. استمر في الشطف. يُحفظ في مكان جيد التهوية. يُحفظ في مكان بارد. تخلص من المحتويات/العبوة وفقًا للوائح المحلية/الإقليمية/الوطنية/الدولية.
تنبيهات المنتج: تحذير: ينتج أزيد الصوديوم حمض الهيدرازويك شديد السمية في الظروف الحمضية. خفف مركبات الأزيد بالماء الجاري قبل التخلص منها لتجنب تراكم رواسب قابلة للانفجار في أنابيب الصرف الصحي. يرجى زيارة http://regdocs.bd.com للاطلاع على صحائف بيانات السلامة (SDS). يرجى زيارة www.bdbiosciences.com/us/s/resources للاطلاع على البروتوكولات الفنية.
الوصف: الكمية/الحجم: رقم القطعة: معرف EntrezGene
غير متوفر : لا شيء : غير متوفر : غير متوفر