BD، 640176، مجموعة اختبار الكالسيوم BD™

التطبيق: فحص وظيفي (يتم اختباره بشكل روتيني)
الوضع التنظيمي: للاستخدام البحثي فقط
الوصف: المكونات: مؤشر الكالسيوم، قارورة واحدة مجففة بالتجميد، مُحسِّن إشارة PBX 10X، 10 مل، محلول قياس الكالسيوم، 90 مل. تتيح مجموعة BD™ PBX لقياس الكالسيوم قياسًا متجانسًا لتغيرات الكالسيوم داخل الخلايا الناتجة عن تنشيط مستقبلات البروتين G المقترنة أو قنوات الكالسيوم. يتضمن القياس خطوة واحدة فقط لإضافة الصبغة ولا يتطلب غسلًا، مما يسهل تطبيقه في بيئة ذات إنتاجية عالية. لا يتطلب استخدام البروبينسيد، وهو مثبط قياسي لنقل الأنيونات غير النوعي، لتحميل الصبغة في خطوط خلايا CHO وHela وBD™ ACTOne باستخدام هذه المجموعة، ولكنه قد يُحسِّن من احتفاظ الخلايا بالصبغة.
التحضير والتخزين: يجب حماية مؤشر الكالسيوم من الضوء وتخزينه عند درجة حرارة -20 درجة مئوية. يجب تخزين مُحسِّن الإشارة 10X ومحلول قياس الكالسيوم في درجة حرارة الغرفة.
إجراءات التحليل الموصى بها: بروتوكول تحليل تدفق الكالسيوم. ملاحظة: يرجى قراءة البروتوكول بالكامل قبل بدء التجربة. المواد غير المشمولة: 100% DMSO، سيجما D4540، بروبينسيد (اختياري)، سيجما P8761. تحضير الخلايا: يجب تحديد عدد الخلايا الأمثل لكل تحليل. تتطلب ظروف التحليل المثلى طبقة أحادية متصلة من الخلايا قبل إجراء التحليل. - بالنسبة للخلايا الملتصقة، ازرع من 50 ألف إلى 70 ألف خلية/بئر في صفيحة 96 بئرًا، ومن 12 ألف إلى 20 ألف خلية/بئر في صفيحة 384 بئرًا في اليوم السابق للتجربة. أضف 100 ميكرولتر/بئر من معلق الخلايا إلى صفائح 96 بئرًا، أو 25 ميكرولتر/بئر إلى صفائح 384 بئرًا، واترك الخلايا تلتصق وتنمو طوال الليل لمدة 16 إلى 24 ساعة في حاضنات زراعة الخلايا. قبل تحميل الصبغة على الصفيحة، افحص الخلايا للتأكد من اتساعها وصحتها العامة. بالنسبة للخلايا غير الملتصقة، ضع 100 ميكرولتر من الخلايا في وسط الاستنبات في كل بئر من أطباق 96 بئراً، أو 25 ميكرولتر في كل بئر من أطباق 384 بئراً المطلية ببولي-دي لايسين أو أي مادة خارج خلوية أخرى، وذلك قبل التجربة بساعتين. اترك الخلايا تستقر وتلتصق بقاع الأطباق في درجة حرارة الغرفة. قم بالطرد المركزي لفترة وجيزة مع إيقاف تشغيل المكابح قبل بدء التجربة. تحضير محلول تحميل الصبغة بتركيز 1X: 1. أخرج قارورة مؤشر الكالسيوم من درجة حرارة -20 درجة مئوية، واتركها في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق لتسخينها. أضف 100 ميكرولتر من ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) النقي، وأعد إذابة الراسب عن طريق سحب المحلول ودفعه عدة مرات باستخدام الماصة. ملاحظة: لإذابة مؤشر الكالسيوم تماماً، احتفظ بمؤشر الكالسيوم المُذاب في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق قبل تحضير محلول تحميل الصبغة بتركيز 1X. ٢. لتحضير مُحسِّن إشارة PBX بتركيز 1X، انقل 10 مل من مُحسِّن إشارة PBX بتركيز 10X إلى 90 مل من محلول قياس الكالسيوم بتركيز 1X، واخلط جيدًا. ملاحظة: البروبينسيد ليس ضروريًا لتحميل الصبغة، على الرغم من أنه غالبًا ما يُحسِّن احتفاظ الخلايا بها. بالنسبة للخلايا التي تتطلب البروبينسيد للتحميل (مثل خلايا CHO)، حضِّر محلولًا مركزًا جديدًا من البروبينسيد في هيدروكسيد الصوديوم بتركيز 1N، ثم خفِّف المحلول المركز في مُحسِّن إشارة PBX بتركيز 1X إلى تركيز يتراوح بين 1 و5 ملي مولار إذا رغبت في ذلك. ٣. لتحضير محلول تحميل الصبغة بتركيز 1X لطبق خلية واحد، اسحب 10 مل من مُحسِّن إشارة PBX بتركيز 1X باستخدام ماصة وضعها في أنبوب منفصل، وأضف 10 ميكرولتر من مؤشر الكالسيوم إلى 10 مل من مُحسِّن إشارة PBX بتركيز 1X، واخلط عن طريق قلب الأنبوب عدة مرات. ٤. قسّم مؤشر الكالسيوم غير المستخدم إلى عدة أنابيب طرد مركزي صغيرة، وأحكم إغلاقها، وخزّنها في درجة حرارة -٢٠ درجة مئوية. يمكن تخزين مُحسِّن إشارة PBX بتركيز ١X في درجة حرارة الغرفة. ملاحظة: يبقى مؤشر الكالسيوم المُعاد تكوينه مستقرًا لأكثر من شهر إذا تم إحكام إغلاق الأنبوب. للحصول على أفضل النتائج، ضع الأنابيب في كيس بلاستيكي قابل للإغلاق مع مادة مجففة، وتجنب دورات التجميد والذوبان المتكررة. تحميل الصبغة: ١. أخرج صفائح الخلايا من الحاضنة، وأضف حجمًا مساويًا من محلول تحميل الصبغة بتركيز ١X إلى كل بئر (على سبيل المثال، ١٠٠ ميكرولتر إلى ١٠٠ ميكرولتر من وسط الاستنبات/بئر لصفائح ٩٦ بئرًا، أو ٢٥ ميكرولتر إلى ٢٥ ميكرولتر من وسط الاستنبات/بئر لصفائح ٣٨٤ بئرًا). ملاحظة: لا تتداخل مكونات المجموعة مع المصل أو الفينول الأحمر. مع ذلك، بالنسبة لبعض التحليلات التي تتطلب بيئة خالية من المصل، يجب إزالة وسط الاستنبات المحتوي على المصل قبل تحميل الصبغة واستبداله بحجم مماثل من محلول تحميل الصبغة بتركيز 0.5X. يبقى محلول تحميل الصبغة بتركيز 1X مستقرًا لمدة 8 إلى 12 ساعة في درجة حرارة الغرفة، ولمدة أسبوعين إلى ثلاثة أسابيع عند درجة حرارة -20 درجة مئوية. 2. حضّن أطباق الخلايا مع الصبغة لمدة ساعة واحدة في حاضنة استنبات الخلايا. ملاحظة: إذا كان سيتم إجراء تحليل تدفق الكالسيوم في درجة حرارة الغرفة، ضع أطباق الخلايا في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة على الأقل لتبرد قبل وضعها على أجهزة القراءة. إذا كان تحليل تدفق الكالسيوم يتطلب 37 درجة مئوية، فأجرِ التحليل فورًا بعد تحميل الصبغة. تحليل تدفق الكالسيوم: ضع أطباق الخلايا على جهاز FLIPR أو FlexStation أو FDSS، وأجرِ تحليل تدفق الكالسيوم كما هو موضح في كتيبات الأجهزة. لإجراء التحليلات على جهاز FlexStation، استخدم معايير الطول الموجي التالية: الإثارة: 485 نانومتر، الانبعاث: 525 نانومتر، القطع التلقائي: مُفعّل (515 نانومتر). بالنسبة للتحليلات التي تُجرى على جهازي FLIPR وFDSS، استخدم المرشحات القياسية لتحليلات الكالسيوم. ملاحظة: يجب تحسين سرعة وارتفاع إضافة المركب لكل تحليل. يُوصى عمومًا بسرعة إضافة أعلى من إعدادات تحليلات تدفق الكالسيوم الأخرى. دليل استكشاف الأخطاء وإصلاحها: 1. إشارة فلورية أساسية منخفضة: "افحص كثافة الخلايا وشكلها تحت المجهر. قد تؤدي الكثافة الخلوية المنخفضة أو الخلايا غير الصحية إلى إشارة أساسية منخفضة." تحقق من تخزين مؤشر الكالسيوم. يجب تخزين مؤشر الكالسيوم في أنبوب محكم الإغلاق ومجمد مع مادة مجففة. بمجرد إعادة تكوينه، يجب تجنب دورات التجميد والذوبان المتكررة. 1. تأكد من خلط مؤشر الكالسيوم جيدًا مع مُحسِّن إشارة PBX بتركيز 1X قبل إضافة الصبغة. 2. استجابة أقل من المتوقع للمُحفِّز: تحقق من الحالة الصحية العامة للخلايا. قد تكون كثافة الخلايا مرتفعة جدًا أو منخفضة جدًا. قد يكون من الضروري معايرة عدد الخلايا. 3. اختلافات بين الآبار بعد إضافة المُحفِّز: اضبط ارتفاع وسرعة التوزيع لإضافة الليجاند لضمان الخلط الفوري. يجب توزيع الخلايا بالتساوي بين الآبار. قبل الزرع، افحص المزرعة مجهريًا للتأكد من تفككها إلى خلايا منفردة. تستجيب الخلايا المتكتلة بتفاوت أكبر. تحقق من نظام معالجة السوائل للتأكد من دقة التوزيع. 4. استجابة الخلايا بعد إضافة المحلول المنظم: قد تستجيب الخلايا غير الصحية لإضافة المحلول المنظم. تأكد من أن الخلايا ليست مكتظة جدًا أو غير صحية قبل الزرع. تتأثر الخلايا بسرعة إضافة المركب العالية. اضبط سرعة وارتفاع الماصة بشكل صحيح لتجنب تحفيز الخلايا بالقوى الفيزيائية أثناء إضافة المركب. 5. استجابة الخلايا بعد إضافة محلول منظم يحتوي على ثنائي ميثيل سلفوكسيد فقط: "إذا أُجريت تجربة تدفق الكالسيوم في درجة حرارة الغرفة، اترك أطباق الخلايا لتستقر في درجة حرارة الغرفة لفترة أطول (ساعة واحدة مثلاً) بعد تحميل الصبغة عند 37 درجة مئوية. "اسمح للخلايا بالتكيف مع بيئة ثنائي ميثيل سلفوكسيد قبل إضافة الدواء عن طريق إضافة ثنائي ميثيل سلفوكسيد إلى محلول تحميل الصبغة (بتركيز أقل قليلاً من التركيز النهائي لثنائي ميثيل سلفوكسيد بعد إضافة الدواء).