BD، 559063، BD Pharmingen™ مضاد الفئران IL-10 النقي

الاسم البديل: إنترلوكين-10؛ Il10؛ CSIF؛ عامل تثبيط تخليق السيتوكين
التفاعل: الفأر (اختبار مراقبة الجودة)
النمط المصلي: IgG2b للفئران
المستضد: إنترلوكين-10 الفأري المؤتلف
التطبيق: التلوين داخل الخلايا (قياس التدفق الخلوي) (يتم اختباره بشكل روتيني)، الكيمياء المناعية الخلوية (يتم اختبارها أثناء التطوير)
التركيز: 0.5 ملغم/مل
RRID: AB_2125127
محلول التخزين: محلول مائي منظم يحتوي على ≤0.09% من أزيد الصوديوم.
الوضع التنظيمي: للاستخدام البحثي فقط
التحضير والتخزين: يُحفظ غير مخفف عند درجة حرارة 4 درجات مئوية. تم تنقية الجسم المضاد أحادي النسيلة من سائل مزرعة الأنسجة أو السائل الاستسقائي بواسطة كروماتوغرافيا التقارب.
إجراءات الفحص الموصى بها: الفحص المناعي الخلوي: يمكن استخدام صيغة الفحص المناعي الخلوي (ICC) للأجسام المضادة JES5-16E3 النقية (رقم المنتج 559063) لتحديد وحصر الخلايا المنتجة للإنترلوكين-10 (IL-10) باستخدام الفحص المناعي الخلوي. وللحصول على أفضل تلوين مناعي خلوي غير مباشر، يجب معايرة الأجسام المضادة JES5-16E3 (≤ 1 ميكروغرام) وتصويرها من خلال إجراء تلوين من ثلاث خطوات باستخدام البيوتين، وهو عبارة عن جسم مضاد IgG مضاد للفئران من الماعز، ومقترن أفيدين/ستربتافيدين-بيروكسيداز الفجل. يرد أدناه بروتوكول مفصل لإجراء الفحص المناعي الخلوي للسيتوكينات. بروتوكول الكيمياء المناعية الخلوية للسيتوكينات - الكواشف المطلوبة: 1. محلول التثبيت: يُذاب 5% فورمالين (أو 10% فورمالين، CMS، رقم المنتج 245-684) في محلول ملحي مُخفف بالفوسفات (PBS) (محلول Bacto FA، مختبرات Difco، رقم المنتج 2314-15-0)، أو محلول تثبيت BD Pharmingen™ ICC (BD، رقم المنتج 550010). 2. محلول حجب البيروكسيداز الداخلي: كاشف حجب البيروكسيداز DAKO (DAKO، رقم المنتج S2001). 3. محلول حجب البيوتين الداخلي: مجموعة حجب البيوتين/أفيدين (مختبرات Vector، رقم المنتج SP-2001). ٤. محلول تخفيف الأجسام المضادة: محلول تخفيف الأجسام المضادة IHC من BD Pharmingen™ (رقم المنتج ٥٥٩١٤٨) مُدعّم بالصابونين. ٥. شرائح مجهرية: شرائح لاصقة (شركة إيري ساينتيفيك، رقم المنتج ER-٢٠٢B-AD) أو شرائح Colorfrost /Plus (شركة فيشر، رقم المنتج ١٢-٥٥٠-١٧) للتحضير الخلوي. ٦. نظام الكشف: ستربتأفيدين-بيروكسيداز الفجل (HRP) من BD Pharmingen™ (رقم المنتج ٥٥٠٩٤٦) أو مجموعة الكشف عن الأجسام المضادة للفئران Ig HRP (رقم المنتج ٥٥١٠١٣). ٧. وسط تثبيت للتخزين قصير الأجل: Aqua-mount® (مختبرات ليرنر، رقم المنتج ١٣٨٠٠). ٨. مجموعة ركيزة DAB (تحتوي على 3،3-ثنائي أمينوبنزيدين رباعي هيدروكلوريد)، (رقم كتالوج BD: 550880 أو مجموعة الكشف عن الأجسام المضادة Ig للفئران HRP (رقم الكتالوج: 551013). الأجسام المضادة الثانوية: بيوتين الماعز المضاد لـ IgG للفئران (رقم الكتالوج: 559286) أو مجموعة الكشف عن الأجسام المضادة Ig للفئران HRP (رقم الكتالوج: 551013). إجراء التلوين المناعي الخلوي لتحضيرات الخلايا المفردة: يصف هذا الإجراء تقنية التلوين المناعي الإنزيمي للسيتوكينات داخل الخلايا المفردة المثبتة على شرائح مجهرية عن طريق الالتصاق (شرائح لاصقة) أو الطرد المركزي (أجهزة الطرد المركزي الخلوي). الشرائح اللاصقة: 1. اجمع الخلايا واغسلها مرتين في محلول ملحي فوسفاتي باستخدام الطرد المركزي (400 × جم). 1. اغسل الشرائح لمدة 5 دقائق لإزالة البروتين المتبقي. 2. اضبط تركيز الخلايا عند 4-5 × 10⁶ خلية/مل في محلول الفوسفات الملحي (PBS). 3. ضع 20 ميكرولتر من معلق الخلايا في كل بئر من شرائح الالتصاق واتركها تلتصق في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة. يُرجى ملاحظة أنه يجب غسل الشرائح في محلول الفوسفات الملحي (PBS) في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق قبل نقل الخلايا. 4. ثبّت الخلايا على الشرائح باستخدام محلول التثبيت لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. 5. اغسل الشرائح مرتين في محلول الفوسفات الملحي (PBS) مع حضانة لمدة 5 دقائق. 6. احجب الشرائح بمحلول الفوسفات الملحي (PBS) المُضاف إليه 1% (وزن/حجم) من ألبومين المصل البقري (BSA) (سيجما، رقم المنتج A43-78) لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة أو 10 دقائق عند 37 درجة مئوية. 7. اغسل الشرائح مرتين في محلول الفوسفات الملحي (PBS) ثم تابع عملية التلوين أو جففها بالهواء واحفظها عند -80 درجة مئوية للاستخدام لاحقًا. 8. حضّن الشرائح مع 1. أضف 20 ميكرولتر من مصل الماعز بتركيز 1% ومحلول الفوسفات الملحي (PBS) مع 0.1% (وزن/حجم) من الصابونين لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. 2. اغسل الشرائح مرتين بمحلول الفوسفات الملحي (PBS) مع حضانة لمدة 5 دقائق. 3. قم بتثبيط نشاط البيروكسيداز الداخلي باستخدام محلول تثبيط البيروكسيداز الداخلي (20 ميكرولتر/بئر) لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. 4. اغسل مرتين بمحلول الفوسفات الملحي (PBS) مع حضانة لمدة 5 دقائق. 5. حضّن كل بئر مع الأفيدين (20 ميكرولتر/بئر) لمدة 15 دقيقة. 6. اغسل مرتين بمحلول الفوسفات الملحي (PBS) مع حضانة لمدة 5 دقائق. 7. حضّن كل بئر مع البيوتين (20 ميكرولتر/بئر) لمدة 15 دقيقة. 8. اغسل مرتين بمحلول الفوسفات الملحي (PBS) مع حضانة لمدة 5 دقائق. 9. حضّن كل بئر لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة مع 20 ميكرولتر من المحلول النقي. 17. اغسل الشرائح مرتين بمحلول الفوسفات الملحي (PBS) مع حضانة لمدة 5 دقائق. 18. حضّن كل بئر بـ 20 ميكرولتر من جسم مضاد ثانوي مُؤشَّر بالبيوتين مُخفَّف في محلول الفوسفات الملحي (PBS) مع إضافة الصابونين. 19. اغسل الشرائح مرتين بمحلول الفوسفات الملحي (PBS) مع حضانة لمدة 5 دقائق. 20. ضع 20 ميكرولتر من ستربتأفيدين-HRP (رقم المنتج 550946) على كل بئر في الشرائح وحضّن لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. 21. اغسل الشرائح مرتين بمحلول الفوسفات الملحي (PBS) مع حضانة لمدة 5 دقائق. 22. حضّن مع ركيزة DAB وفقًا للتعليمات (رقم المنتج 550946). 550880) لمدة تقل عن 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. 23. أوقف تفاعل اللون بالغسل بمحلول الفوسفات الملحي (PBS). 24. تُثبّت الشرائح بعد ذلك في وسط تثبيت للتخزين قصير الأجل. أجهزة الطرد المركزي (CYTOSPINS): 1. جهّز حجرة عينة جهاز الطرد المركزي (مثل Cytospin 3، Shandon، المملكة المتحدة أو جهاز طرد مركزي مماثل)، وبطاقة الترشيح، والشرائح، وحامل جهاز الطرد المركزي وفقًا لمواصفات الشركة المصنعة. 2. ضع 40 ميكرولتر من حوالي 1 × 10⁶ خلية في كل حجرة عينة. 3. قم بتدوير الشرائح بسرعة 600 دورة في الدقيقة لمدة دقيقتين. 4. أخرج الشرائح من حامل جهاز الطرد المركزي وضعها على حامل التلوين. 5. للتثبيت والتلوين، يُرجى اتباع الخطوات من 4 إلى 24 المذكورة أعلاه لتلوين الخلايا على شرائح الالتصاق.
ملاحظات المنتج: نظرًا لاختلاف التطبيقات، ينبغي على كل باحث معايرة الكاشف للحصول على أفضل النتائج. يُعد أزيد الصوديوم مثبطًا عكسيًا لعملية الأيض التأكسدي؛ لذا، يجب عدم استخدام مستحضرات الأجسام المضادة التي تحتوي على هذه المادة الحافظة في مزارع الخلايا أو حقنها في الحيوانات. يمكن إزالة أزيد الصوديوم بغسل الخلايا المصبوغة أو الأجسام المضادة المرتبطة بالصفيحة، أو بغسل الأجسام المضادة الذائبة في محلول منظم خالٍ من أزيد الصوديوم. نظرًا لأن السموم الداخلية قد تؤثر أيضًا على نتائج الدراسات الوظيفية، نوصي باستخدام صيغة الأجسام المضادة NA/LE (خالية من الأزيد/منخفضة السموم الداخلية)، إن توفرت، للاستخدام في المختبر وفي الجسم الحي. تحذير: ينتج عن أزيد الصوديوم حمض الهيدرازويك شديد السمية في الظروف الحمضية. خفف مركبات الأزيد بالماء الجاري قبل التخلص منها لتجنب تراكم رواسب قابلة للانفجار في أنابيب الصرف الصحي. يرجى مراجعة www.bdbiosciences.com/us/s/resources للاطلاع على البروتوكولات الفنية.