مجموعة BD OptEIA™ Human CD253 (TRAIL) ELISA، رقم 550948

التفاعل: بشري (اختبار مراقبة الجودة)
التطبيق: اختبار ELISA، التقاط ELISA، الكشف عن ELISA (يتم اختباره بشكل روتيني)
الوضع التنظيمي: للاستخدام البحثي فقط
RRID: AB_2868911
الوصف: تحتوي مجموعة OptEIA™ الخاصة بالرابط المحفز للاستماتة المرتبط بعامل نخر الورم (TRAIL) على المكونات اللازمة لتطوير فحوصات الامتصاص المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA) للكشف عن TRAIL البشري الطبيعي أو المُعاد تركيبه في المصل والبلازما وسوائل مزارع الخلايا. تُوفر مواد كافية لتحضير ما يقارب 20 صفيحة من 96 بئرًا، شريطة اتباع تعليمات التخزين والمواد وتحضير المحلول المنظم وإجراء الفحص الموصى بها والموضحة في هذه العبوة. تحسين الفحص: تتيح مجموعات BD OptEIA™ تصميمًا مرنًا للفحص بما يتناسب مع احتياجات كل مختبر. لتصميم فحص مناعي بحساسية ونطاق ديناميكي مختلفين، يمكن تغيير المعايير التالية: الالتقاط، معايرة الأجسام المضادة للكشف، وقت الحضانة، درجة حرارة الحضانة، تركيبة مخفف الفحص، درجة حموضة المحلول المنظم، القوة الأيونية، تركيز البروتين، نوع الركيزة، تقنية الغسل (أي عدد مرات الغسل وأوقات النقع). المعايرة: تتم معايرة هذا الفحص المناعي باستخدام بروتين TRAIL البشري المؤتلف النقي.
التحضير والتخزين: تُحفظ الكواشف غير المفتوحة في درجة حرارة تتراوح بين 2 و8 درجات مئوية. لا تستخدم الكواشف بعد تاريخ انتهاء الصلاحية، أو إذا ظهرت عليها عكارة. قبل الاستخدام، اترك جميع الكواشف لتصل إلى درجة حرارة الغرفة (18-25 درجة مئوية). بعد الاستخدام مباشرة، أعدها إلى ظروف التخزين المناسبة. تبقى المعايير المجففة بالتجميد مستقرة حتى تاريخ انتهاء الصلاحية. بعد إعادة تكوين المحلول، قسّم المحلول القياسي مباشرةً إلى حصص في قوارير من البولي بروبيلين بمقدار 50 ميكرولتر لكل قارورة، ثم جمّدها عند درجة حرارة -80 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر. إذا لزم الأمر، خزّن المحلول في درجة حرارة تتراوح بين 2 و8 درجات مئوية لمدة تصل إلى 8 ساعات قبل تقسيمه إلى حصص وتجميده. لا تترك المحلول القياسي المُعاد تكوينه في درجة حرارة الغرفة.
إجراءات التحليل الموصى بها: المحاليل المنظمة الموصى بها. ملاحظة: لا تستخدم أزيد الصوديوم في هذه التحضيرات. يُعطّل أزيد الصوديوم إنزيم بيروكسيداز الفجل. يُوصى باستخدام مجموعة كواشف BD OptEIA™ B (رقم المنتج 550534) التي تحتوي على محلول التغطية، ومخفف التحليل، وكواشف الركيزة A وB، ومحلول الإيقاف، ومحلول غسيل مركز 20X. 1. محلول التغطية - كربونات الصوديوم 0.1 مولار، درجة الحموضة 9.5؛ 7.13 غرام من بيكربونات الصوديوم، 1.59 غرام من كربونات الصوديوم؛ يُكمل الحجم إلى 1.0 لتر؛ تُضبط درجة الحموضة إلى 9.5 باستخدام هيدروكسيد الصوديوم 10 مولار. يُحضر طازجًا أو يُستخدم خلال 7 أيام من التحضير، ويُخزن في درجة حرارة 2-8 درجة مئوية. 2. مخفف التحليل - محلول فوسفات ملحي* مع 10% مصل بقري جنيني#، درجة الحموضة 7.0. يُوصى باستخدام مُخفِّف اختبار BD Pharmingen™ (رقم المنتج 555213). *محلول ملحي مُخفَّف بالفوسفات: 80.0 غ كلوريد الصوديوم، 11.6 غ فوسفات ثنائي هيدروجين الصوديوم، 2.0 غ فوسفات ثنائي هيدروجين البوتاسيوم، 2.0 غ كلوريد البوتاسيوم، كمية كافية حتى 10 لترات؛ درجة الحموضة حتى 7.0. #مصل جنيني بقري: يُوصى باستخدام Hyclone رقم المنتج SH30088 (مُعطَّل بالحرارة). يُحضَّر طازجًا أو يُستخدم في غضون 3 أيام من التحضير، مع التخزين في درجة حرارة 2-8 درجة مئوية. 3. محلول التحلل - 10 ملي مولار Tris درجة الحموضة 7.5، 130 ملي مولار كلوريد الصوديوم، 1% Triton-X100، 10 ملي مولار فلوريد الصوديوم، 10 ملي مولار فوسفات الصوديوم، 10 ملي مولار بيروفوسفات الصوديوم. يُوصى باستخدام محلول تحلل خلايا الحشرات BD Pharmingen™ (رقم المنتج 554778). 4. مزيج مثبطات البروتياز - يُوصى باستخدام مزيج مثبطات البروتياز BD Pharmingen™ (رقم المنتج 554779). مزيج مثبطات البروتياز 50X: 800 ميكروغرام/مل من بنزاميدين هيدروكلوريد، 500 ميكروغرام/مل من فينانثرولين، 500 ميكروغرام/مل من أبروتينين، 500 ميكروغرام/مل من ليوبيبتين، 500 ميكروغرام/مل من بيبستاتين أ، 50 ملي مولار من فينيل ميثيل سلفونيل فلورايد. 5. محلول الغسل - محلول ملحي فوسفاتي* مع 0.05% توين-20. يُحضّر طازجًا أو يُستخدم خلال 3 أيام من التحضير، ويُحفظ في درجة حرارة 2-8 درجة مئوية. 6. محلول الركيزة - رباعي ميثيل بنزيدين (TMB) وبيروكسيد الهيدروجين. يُوصى باستخدام مجموعة كواشف ركيزة TMB من BD Pharmingen™ (رقم المنتج 555214). 7. محلول الإيقاف - حمض الفوسفوريك 1 مولار أو حمض الكبريتيك 2 مولار. المواد الإضافية المطلوبة: 1. يُوصى باستخدام صفائح ELISA من BD Falcon™ ذات 96 بئرًا (رقم المنتج 353279). 2. قارئ صفائح دقيقة قادر على قياس الامتصاص عند 450 نانومتر. 3. ماصات دقيقة. 4. أسطوانة مدرجة سعة لتر واحد. 5. ماء منزوع الأيونات أو مقطر. 6. زجاجة غسيل أو غسالة آلية. 7. ورق رسم بياني لوغاريتمي أو معالجة آلية للبيانات. 8. أنابيب لتحضير التخفيفات القياسية. 9. مؤقت مختبري. 10. أغطية صفائح أو غشاء بارافين. جمع العينات ومعالجتها: يجب أن تكون العينات صافية، وغير متحللة الدم، وغير دهنية. مستخلص الخلية: انظر "تحضير العينة" أدناه. سائل مزرعة الخلايا: أزل أي مواد جسيمية بالطرد المركزي، ثم قم بإجراء التحليل فورًا أو خزّن العينات عند درجة حرارة ≤ -20 درجة مئوية. تجنب دورات التجميد والذوبان المتكررة. المصل: استخدم أنبوب فصل المصل، واترك العينات تتخثر لمدة 30 دقيقة، ثم قم بالطرد المركزي لمدة 10 دقائق عند 1000 × g. أزل المصل وقم بإجراء التحليل فورًا أو خزّن العينات عند درجة حرارة ≤ -20 درجة مئوية. تجنب دورات التجميد والذوبان المتكررة. البلازما: اجمع البلازما باستخدام السترات أو EDTA أو الهيبارين كمضاد للتخثر. قم بالطرد المركزي لمدة 10 دقائق عند 1000 × g في غضون 30 دقيقة من الجمع. قم بإجراء التحليل فورًا أو خزّن العينات عند درجة حرارة ≤ -20 درجة مئوية. تجنب دورات التجميد والذوبان المتكررة. تحضير المعايير والتعامل معها: 1. إعادة التكوين: بعد تسخين المعيار المجفف بالتجميد إلى درجة حرارة الغرفة، افتح القارورة بحرص لتجنب فقدان المادة. أعد تكوين المحلول القياسي المجفف بالتجميد بإضافة 1.0 مل من الماء منزوع الأيونات للحصول على محلول قياسي مركز. اترك المحلول القياسي حتى يصل إلى حالة التوازن لمدة 15 دقيقة على الأقل قبل إجراء التخفيفات. رجّ المحلول برفق باستخدام جهاز الرجّ. 2. تخزين/معالجة المحلول القياسي المُعاد تكوينه: بعد إعادة التكوين، قسّم المحلول القياسي المركز فورًا إلى حصص في قوارير بولي بروبيلين، 50 ميكرولتر لكل قارورة، ثم جمّدها عند درجة حرارة -80 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر. إذا لزم الأمر، خزّنها عند درجة حرارة 2-8 درجة مئوية لمدة تصل إلى 8 ساعات قبل تقسيمها إلى حصص وتجميدها. لا تترك المحلول القياسي المُعاد تكوينه في درجة حرارة الغرفة. 3. تحضير المحاليل القياسية للتحليل: أ. حضّر محلولًا قياسيًا بتركيز 4000 بيكوغرام/مل من المحلول القياسي المركز. رجّ المحلول جيدًا باستخدام جهاز الرجّ. (راجع تعليمات التخفيف في شهادة التعليمات/التحليل). ب. أضف 300 ميكرولتر من مخفف التحليل إلى 6 أنابيب. قم بتسمية العينات بالتركيزات التالية: 2000 بيكوغرام/مل، 1000 بيكوغرام/مل، 500 بيكوغرام/مل، 250 بيكوغرام/مل، 125 بيكوغرام/مل، و62.5 بيكوغرام/مل. ج. قم بإجراء تخفيفات متسلسلة بإضافة 300 ميكرولتر من كل معيار إلى الأنبوب التالي مع الخلط باستخدام جهاز الخلط الدوامي بين كل عملية نقل. يُستخدم مخفف المعايرة كمعيار صفري (0 بيكوغرام/مل). تحضير العينة أ. محلول التحلل المُحضر: يُقدم مزيج مثبطات البروتياز من BD Pharmingen™ (رقم المنتج 554779) على شكل مسحوق مجفف بالتجميد. قبل الاستخدام، أضف 1.0 مل من الإيثانول النقي للحصول على مزيج مثبطات البروتياز بتركيز 50 ضعفًا. أضف مزيج مثبطات البروتياز المُعاد تكوينه بنسبة 1:50 إلى محلول التحلل مباشرةً قبل الاستخدام. يُحفظ مزيج مثبطات البروتياز المُعاد تكوينه دائمًا عند درجة حرارة ≤ -20 درجة مئوية. مستخلص الخلايا: 1. عدّ الخلايا لتحديد عددها لكل مل. 2. افصل الخلايا بالطرد المركزي عند 2500 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق. 3. أعد تعليق الخلايا المترسبة في محلول التحلل المُحضر والمُبرد بالثلج. استخدم 1 مل من محلول التحلل لكل 4 × 10^6 خلية. حلل الخلايا على الثلج لمدة 45 دقيقة. 4. صفّ المستخلص من بقايا الخلايا بالطرد المركزي عند 40000 دورة في الدقيقة لمدة 45 دقيقة. 5. اجمع السائل الطافي الصافي للتحليل. إجراء الفحص المُوصى به: 1. غطِّ الآبار الدقيقة بـ 100 ميكرولتر لكل بئر من الأجسام المضادة المُلتقطة المُخففة في محلول التغطية. للاطلاع على التخفيف المُوصى به لتغطية الأجسام المضادة، راجع التعليمات/شهادة التحليل الخاصة بالدفعة. 1. أغلق الصفيحة بإحكام واحضنها طوال الليل عند درجة حرارة 4 مئوية. 2. اسحب المحلول من الآبار واغسلها 3 مرات باستخدام 300 ميكرولتر أو أكثر من محلول الغسل لكل بئر. بعد الغسلة الأخيرة، اقلب الصفيحة وجففها بورق ماص لإزالة أي محلول متبقٍ. 3. أغلق الصفيحة باستخدام 200 ميكرولتر أو أكثر من مخفف المعايرة لكل بئر. احضنها في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. 4. اسحب المحلول واغسلها كما في الخطوة 2. 5. حضّر تخفيفات المعيار والعينة في مخفف المعايرة. راجع "تحضير المعايير والتعامل معها". 6. ضع 100 ميكرولتر من كل معيار وعينة وعينة تحكم في الآبار المناسبة باستخدام ماصة. أغلق الصفيحة بإحكام واحضنها لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة. 7. اسحب المحلول واغسلها كما في الخطوة 2، ولكن مع 5 غسلات إجمالاً. 8. أضف 100 ميكرولتر من كاشف العمل (جسم مضاد للكشف + كاشف SAv-HRP) إلى كل بئر. أغلق الصفيحة بإحكام وحضّنها لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. 9. اسحب المحلول واغسل الصفيحة كما في الخطوة 2، ولكن مع 7 غسلات إجمالاً. ملاحظة: في خطوة الغسل الأخيرة هذه، انقع الآبار في محلول الغسل لمدة 30 ثانية إلى دقيقة واحدة لكل غسلة. 10. أضف 100 ميكرولتر من محلول الركيزة إلى كل بئر. حضّن الصفيحة (بدون غطاء الصفيحة) لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام. 11. أضف 50 ميكرولتر من محلول الإيقاف إلى كل بئر. 12. اقرأ الامتصاص عند 450 نانومتر في غضون 30 دقيقة من إيقاف التفاعل. إذا كان تصحيح الطول الموجي متاحًا، فاطرح الامتصاص عند 570 نانومتر من الامتصاص عند 450 نانومتر. ملخص إجراء الفحص: 1. أضف 100 ميكرولتر من الجسم المضاد المخفف إلى كل بئر. حضّن الصفيحة طوال الليل عند 4 درجات مئوية. 2. اسحب المحلول واغسل الصفيحة 3 مرات. 3. حجب الصفائح: أضف 200 ميكرولتر من مخفف الفحص إلى كل بئر. 4. حضّن لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. 5. اسحب المحلول واغسله 3 مرات. 6. أضف 100 ميكرولتر من المحلول القياسي أو العينة إلى كل بئر. حضّن لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة. 7. اسحب المحلول واغسله 5 مرات. 8. أضف 100 ميكرولتر من كاشف العمل (الكشف عن الأجسام المضادة + SAv-HRP) إلى كل بئر. حضّن لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. 9. اسحب المحلول واغسله 7 مرات (مع نقع لمدة 30 ثانية إلى دقيقة واحدة). 10. أضف 100 ميكرولتر من محلول الركيزة إلى كل بئر. حضّن لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام. 11. أضف 50 ميكرولتر من محلول الإيقاف إلى كل بئر. اقرأ عند 450 نانومتر خلال 30 دقيقة مع تصحيح الطول الموجي عند 570 نانومتر. حساب النتائج: احسب متوسط ​​الامتصاص لكل مجموعة من المعايير المكررة، وعينات التحكم، والعينات. اطرح متوسط ​​امتصاص المعيار الصفري من كل منها. ارسم منحنى المعايرة على ورق رسم بياني لوغاريتمي، مع وضع تركيز TRAIL على المحور السيني والامتصاصية على المحور الصادي. ارسم منحنى المطابقة الأمثل الذي يمر بنقاط المعايرة. لتحديد تركيز TRAIL في العينات المجهولة، أوجد متوسط ​​قيمة الامتصاصية للعينة المجهولة على المحور الصادي، وارسم خطًا أفقيًا يصل إلى منحنى المعايرة. عند نقطة التقاطع، ارسم خطًا رأسيًا يصل إلى المحور السيني، واقرأ تركيز TRAIL. إذا كانت العينات مخففة، اضرب تركيز TRAIL في معامل التخفيف. يمكن أيضًا استخدام تحليل الانحدار اللوغاريتمي لتقليل البيانات باستخدام الحاسوب. الخصوصية والتفاعل المتبادل: تم اختبار العوامل التالية في اختبار BD OptEIA™ عند تركيز ≥ 100 نانوغرام/مل، ولم يتم رصد أي تفاعل متبادل. بروتين بشري مُعاد التركيب: IL-1α، IL-1β، IL-2، IL-3، IL-4، IL-5، IL-6، IL-7، IL-8، IL-10، IL-12 (p40)، IL-12 (p70)، IL-13، IL-15، GM-CSF، IFN-γ، TNF، LT-α (TNF-β)، TNFRI، TNFRII، IL-1sRI، IL-1sRII، sCD40، IL-4sR. محددات الإجراء: • يجب تخفيف العينات التي تُظهر قيم امتصاص أعلى من منحنى المعايرة باستخدام مُخفف المعايرة القياسي وإعادة تحليلها. • لم يتم التحقق بشكل كامل من تداخل مستقلبات الدواء أو المستقبلات الذائبة أو البروتينات الرابطة الأخرى في العينات. لا يمكن استبعاد احتمال حدوث تداخل. صُممت مجموعات BD OptEIA™ للاستخدام كوحدة متكاملة. لا تخلط الكواشف من دفعات مختلفة من المجموعة. لا يُنصح باستخدام كواشف من شركات مصنعة أخرى في هذه المجموعة.
إشعارات المنتج: للحصول على تدريب عبر الإنترنت حول تقنيات ELISA لمجموعة BD OptEIA™، يُرجى الرجوع إلى الرابط التالي: http://www.bdbiosciences.com/OptEIA/downloads.shtml. يجب تخفيف العينات التي تُظهر قيم امتصاص أعلى من منحنى المعايرة باستخدام مُخفف المعايرة القياسي وإعادة تحليلها. لم يتم التحقق بشكل كامل من تداخل مستقلبات الأدوية أو المستقبلات الذائبة أو بروتينات الربط الأخرى في العينات. لا يمكن استبعاد احتمال حدوث تداخل. صُممت مجموعات BD OptEIA™ للاستخدام كوحدة متكاملة. لا تخلط الكواشف من دفعات مختلفة من المجموعة. لا يُنصح باستخدام كواشف من شركات مصنعة أخرى في هذه المجموعة. قد تكون الكواشف التي تحتوي على مواد حافظة سامة في حالة الابتلاع أو الاستنشاق أو ملامسة الجلد. تعامل مع جميع عينات المصل والبلازما وفقًا لإرشادات NCCLS لمنع انتقال العدوى المنقولة بالدم. تحذير: ينتج أزيد الصوديوم حمض الهيدرازويك شديد السمية في الظروف الحمضية. خفف مركبات الأزيد بالماء الجاري قبل التخلص منها لتجنب تراكم رواسب قابلة للانفجار في أنابيب الصرف الصحي. مصدر جميع بروتينات المصل هو مسالخ معتمدة من وزارة الزراعة الأمريكية تقع في الولايات المتحدة. ProClin هي علامة تجارية لشركة Rohm and Haas.
الوصف: الكمية/الحجم: رقم القطعة: معرف EntrezGene
غير متوفر : لا شيء : غير متوفر : غير متوفر