BD، 557080، معيار التحكم في النمط المتساوي IgE الفأري النقي κ من BD Pharmingen™

الاسم البديل: النمط الأليلي b، مضاد ثلاثي نيتروفينول
النمط المتماثل: Mouse C57BL/6 IgE, κ
المناعي: TNP- ثقب المفتاح الهيموسيانين البطلينوس
التطبيق: اختبار ELISA (يتم اختباره بشكل روتيني)
التركيز: 0.5 ملغم/مل
RRID: AB_396578
محلول التخزين: محلول مائي منظم يحتوي على ≤0.09% من أزيد الصوديوم.
الوضع التنظيمي: للاستخدام البحثي فقط
التحضير والتخزين: تم تنقية الجسم المضاد أحادي النسيلة من سائل مزرعة الأنسجة أو السائل الاستسقائي بواسطة كروماتوغرافيا التقارب. يُحفظ غير مخفف عند درجة حرارة 4 درجات مئوية.
إجراءات الفحص الموصى بها: بروتوكول فحص ELISA للأجسام المضادة IgE للفأر: أولاً: التغطية بالأجسام المضادة المُثبِّتة: 1. خفف الجسم المضاد أحادي النسيلة المُنقَّى المُثبِّت للأجسام المضادة IgE للفأر (رقم المنتج 553413، السلالة R35-72) إلى تركيز 2 ميكروغرام/مل[أ] في محلول التغطية (انظر المحاليل أدناه). أضف 100 إلى صفيحة ELISA مُحسَّنة لربط البروتين (مثل صفائح BD Falcon™ ELISA، BD Labware، رقم المنتج 353279). 2. رج الصفيحة جيدًا للتأكد من تغطية جميع الآبار بمحلول الأجسام المضادة المُثبِّتة. 3. غطِّ الصفيحة واحضنها لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية أو طوال الليل عند 4 درجات مئوية.[ب] 4. اغسل الصفيحة 3 مرات بمحلول PBS/Tween (انظر المحاليل أدناه). لكل غسلة، تُملأ الآبار بـ 200 ميكرولتر من محلول الفوسفات الملحي/توين وتُترك قبل شفط المحلول أو التخلص منه. كخطوة أخيرة، تُربت الصفيحة على مناشف ورقية لإزالة المحلول الزائد. ثانيًا: الحجب: 1. تُحجب الصفيحة بـ 200 ميكرولتر من محلول الحجب (انظر المحاليل أدناه) لكل بئر. 2. تُغطى الصفيحة وتُحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. 3. تُغسل الصفيحة 3 مرات بمحلول الفوسفات الملحي/توين، كما في القسم الأول، الخطوة 4، من هذا البروتوكول. ثالثًا: تطبيق المعايير والعينات: 1. يُترك العمود 1 كآبار فارغة (أي، بدون إضافة مستضد، 100 ميكرولتر من محلول الحجب فقط لكل بئر). استخدم العمودين 2 و3 لإضافة عينات قياسية مكررة، 100 ميكرولتر لكل بئر: خفف معيار IgE[a] الفأري النقي (رقم المنتج 557079، المستنسخ C38-2؛ أو رقم المنتج 553481، معيار IgE[b] الفأري (المستنسخ C48-2) في سلسلة من 8 تخفيفات ثنائية، في محلول حجب، بدءًا من 0.5. استخدم الأعمدة المتبقية لإضافة عينات بتخفيفات مختلفة في محلول الحجب، 100 ميكرولتر لكل بئر. 2. غطِ الصفيحة واحضنها لمدة ساعة واحدة على الأقل في درجة حرارة الغرفة أو طوال الليل عند 4 درجات مئوية.[b] 3. اغسل الصفيحة 3 مرات بمحلول PBS/Tween، كما في القسم الأول، الخطوة 4، من هذا البروتوكول. رابعًا. التحضين مع جسم مضاد للكشف: 1. خفف مضاد IgE الفأري المُبَيتَن (رقم المنتج 557079، المستنسخ C38-2؛ أو رقم المنتج 553481، معيار IgE[b] الفأري (المستنسخ C48-2) في سلسلة من 8 تخفيفات ثنائية، في محلول حجب، بدءًا من 0.5. 1. خفف محلول أفيدين-HRP (رقم المنتج 554058) أو ستربتأفيدين-HRP (رقم المنتج 554066) بنسبة 1:1000 في محلول الحجب. أضف 100 ميكرولتر لكل بئر. 2. غطِ الصفيحة واحضنها في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. 3. اغسل الصفيحة 6 مرات بمحلول PBS/Tween، كما هو موضح في القسم الأول، الخطوة 4، من هذا البروتوكول. 4. أضف أفيدين- أو ستربتأفيدين-بيروكسيداز الفجل (Av-HRP أو SAv-HRP): 1. خفف Av-HRP (رقم المنتج 554058) أو SAv-HRP (رقم المنتج 554066) بنسبة 1:1000 في محلول الحجب. أضف 100 ميكرولتر لكل بئر. 2. غطِ الصفيحة واحضنها في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. 3. اغسل الصفيحة 6 مرات بمحلول PBS/Tween، كما هو موضح في القسم الأول، الخطوة 4، من هذا البروتوكول. سادساً: إضافة الركيزة والتظهير: 1. قم بإذابة محلول الركيزة (ABTS) (انظر المحاليل أدناه) خلال 20 دقيقة من الاستخدام. أضف 11 ميكرولتر من بيروكسيد الهيدروجين بتركيز 30% (سيجما، رقم المنتج H1009) إلى 11 مل، ثم قم بالخلط باستخدام جهاز الخلط الدوامي. أضف 100 ميكرولتر لكل بئر على الفور، واتركه ليتفاعل في درجة حرارة الغرفة لمدة 20-30 دقيقة. أوقف التفاعل بإضافة 50 ميكرولتر لكل بئر من محلول SDS/DMF (انظر المحاليل أدناه) (اختياري). 2. اقرأ اللوحة عند 405 نانومتر. ملاحظات: أ. في معظم الحالات، يؤدي تغطية اللوحة بالأجسام المضادة الأولية أحادية النسيلة بتركيز 2 ميكروغرام/مل، 100 ميكرولتر لكل بئر، والكشف باستخدام الأجسام المضادة الثانوية أحادية النسيلة المبيوتينية بتركيز 2 ميكروغرام/مل، إلى الحصول على إشارة مرضية للغاية. ومع ذلك، للحصول على إشارة مثالية، يجب على الباحثين معايرة كل جسم مضاد أحادي النسيلة على مدى نطاق من التركيزات (على سبيل المثال، 1 - 8 ميكروغرام/مل). ب. ظروف الحضانة الموصى بها للحصول على حساسية مثلى. ج. يمكن استبدال مُقترن الستربتافيدين/أفيدين-HRP من مورد آخر وتخفيفه وفقًا لتوصيات الشركة المصنعة.
ملاحظات المنتج: نظرًا لاختلاف التطبيقات، ينبغي على كل باحث معايرة الكاشف للحصول على أفضل النتائج. يُرجى الرجوع إلى www.bdbiosciences.com/us/s/resources للاطلاع على البروتوكولات الفنية. يُعد أزيد الصوديوم مثبطًا عكسيًا لعملية الأيض التأكسدي؛ لذلك، يجب عدم استخدام مستحضرات الأجسام المضادة التي تحتوي على هذه المادة الحافظة في مزارع الخلايا أو حقنها في الحيوانات. يمكن إزالة أزيد الصوديوم عن طريق غسل الخلايا المصبوغة أو الأجسام المضادة المرتبطة بالصفيحة، أو عن طريق غسيل الأجسام المضادة الذائبة في محلول منظم خالٍ من أزيد الصوديوم. نظرًا لأن السموم الداخلية قد تؤثر أيضًا على نتائج الدراسات الوظيفية، فإننا نوصي باستخدام صيغة الأجسام المضادة NA/LE (خالية من الأزيد/منخفضة السموم الداخلية)، إن توفرت، للاستخدام في المختبر وفي الجسم الحي. تحذير: يُنتج أزيد الصوديوم حمض الهيدرازويك شديد السمية في الظروف الحمضية. خفف مركبات الأزيد بالماء الجاري قبل التخلص منها لتجنب تراكم رواسب قابلة للانفجار في أنابيب الصرف الصحي.