BD، 557081، مجموعة BD Pharmingen™ لتحديد النمط المصلي للغلوبولين المناعي للفئران بتقنية ELISA

التطبيق: اختبار ELISA (يتم اختباره بشكل روتيني)
الوضع التنظيمي: للاستخدام البحثي فقط
RRID: AB_2869091
الوصف: تُمكّن مجموعة اختبار ELISA لتحديد النمط المصلي للغلوبولين المناعي للفئران من تحديد أنماط الغلوبولين المناعي للفئران بسرعة وكفاءة. تستخدم هذه المجموعة نظامًا مباشرًا مُوسَمًا بإنزيم بيروكسيداز الفجل، كما أن طريقة الاختبار تُغني عن الحاجة إلى تغطية الصفيحة بالمستضد. تُؤدي هذه الميزات إلى تقليل وقت الاختبار بشكل ملحوظ دون المساس بالحساسية. تم إنتاج كل جسم مضاد من مستضد الغلوبولين المناعي (Ig) للفئران، وخضع لاختبارات مكثفة للتأكد من تفاعله مع أنماط الغلوبولين المناعي للفئران. كل جسم مضاد أحادي النسيلة مُخصص لنمطه المصلي المُحدد. مع ذلك، قد يُلاحظ تفاعل متقاطع في بعض الحالات بين زوج الأجسام المضادة لنمط IgG2a للفئران والأجسام المضادة لنمط IgG1 للفئران، وكذلك بين زوج الأجسام المضادة لنمط Igλ للفئران والأجسام المضادة لنمط IgEκ للفئران. العينة الضابطة الموجبة عبارة عن مزيج من الغلوبولينات المناعية أحادية النسيلة النقية للفئران، والتي تتكون من تسعة تركيبات من السلاسل الثقيلة والخفيفة للغلوبولين المناعي (IgG1κ، IgG1λ، IgG2aκ، IgG2aλ، IgG2bκ، IgG2cκ، IgMκ، IgMλ، وIgAκ). المواد المتوفرة:
التحضير والتخزين: يُحفظ غير مخفف في درجة حرارة 4 درجات مئوية، ويُحفظ بعيدًا عن الضوء لفترات طويلة. لا يُجمد. تم تنقية الجسم المضاد أحادي النسيلة من سائل مزرعة الأنسجة أو السائل الاستسقائي باستخدام كروماتوغرافيا التقارب. تم ربط الجسم المضاد بإنزيم بيروكسيداز الفجل (HRP) في ظل الظروف المثلى، وتمت إزالة الجسم المضاد غير المرتبط وإنزيم بيروكسيداز الفجل الحر.
إجراءات الفحص الموصى بها: المواد المطلوبة (غير متوفرة): صفائح ميكروية من البوليسترين أو البولي فينيل كلوريد (PVC) ذات 96 بئرًا، مناسبة لفحص ELISA؛ كما يمكن استخدام الشرائط المعيارية. ماصات دقيقة قادرة على سحب ما بين 50 و200 ميكرولتر. محلول غسيل يحتوي على 0.05% من توين-20 في محلول ملحي فوسفاتي (PBS). تحضير الكواشف: 1. اترك جميع الكواشف لتصل إلى درجة حرارة الغرفة (18-25 درجة مئوية) قبل الاستخدام. 2. محلول التغطية (PBS بتركيز 1X): خفف الكمية المطلوبة من محلول PBS بتركيز 10X بالماء منزوع الأيونات أو المقطر، واخلطها جيدًا (50 مل لكل صفيحة). 3. محلول الحجب: خفف الكمية المطلوبة من محلول BSA بتركيز 10% بنسبة 1:10 باستخدام محلول PBS بتركيز 1X (35 مل لكل صفيحة). 4. خفف خليط المستضد المرجعي الموجب بنسبة 1:50 باستخدام محلول الحجب (1 مل لكل صفيحة). 5. خفف الأجسام المضادة للفأر المضادة للغلوبولين المناعي للفئران والموسومة بإنزيم بيروكسيداز الفجل بنسبة 1:100 باستخدام محلول الحجب (12 مل لكل صفيحة). 6. محلول الركيزة: في غضون 15 دقيقة قبل الاستخدام، امزج أحجامًا متساوية من كاشف الركيزة أ وكاشف الركيزة ب (5 مل من كل محلول لكل صفيحة) في أنبوب زجاجي نظيف أو قارورة. حضّر الكمية المطلوبة لكل اختبار فقط. تخلص من أي محلول عمل متبقٍ بعد الاستخدام. طلاء الأجسام المضادة: ملاحظة: للحصول على أفضل النتائج، يجب تخفيف الكميات المطلوبة من الأجسام المضادة النقية للطلاء مباشرة قبل الاستخدام، ويجب عدم تخزين الأجسام المضادة المخففة لفترة طويلة. لا يجب تجميد العينات المخففة. 7. خفف كمية مناسبة من كل جسم مضاد أحادي النسيلة للفأر مضاد للفئران من النوع المتماثل في محلول الطلاء، وضع 100 ميكرولتر من كل كاشف في الصفوف المناسبة (انظر الشكل 1 للتخطيط المقترح). 8. انقر على الصفيحة برفق لضمان توزيع متساوٍ لمحلول الأجسام المضادة في قاع الآبار. ٩. حضّن العينات مغطاةً عند درجة حرارة ٣٧ درجة مئوية لمدة ساعة واحدة أو عند درجة حرارة ٤ درجات مئوية طوال الليل. ١٠. استخدم محلول الغسيل (٠.٠٥٪ توين-٢٠ في محلول ملحي فوسفاتي) لغسل محتويات الصفيحة باستخدام غسالة صفائح أو جهاز مشابه، مع الحرص على عدم تلوث الآبار بأجسام مضادة مختلفة. ثم رجّ المحتويات المتبقية، وجفف الزائد منها بمنشفة ورقية نظيفة. كرر الغسل ٣ مرات. ١١. أضف ٢٠٠ ميكرولتر من محلول الحجب (انظر تحضير الكاشف، الخطوة ٣) إلى كل بئر، وحضّنها في درجة حرارة الغرفة لمدة ٣٠ دقيقة. ١٢. للتحضير للخطوة ١٣، اغسل ٣ مرات، ورجّ محلول الحجب، وجفف. حضانة العينة: ١٣. ضع ١٠٠ ميكرولتر من كل سائل طافي لمزرعة الخلايا الهجينة المراد اختبارها في أعمدة الصفيحة المناسبة، وحضّنها لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. يجب تضمين الضوابط الإيجابية (انظر تحضير الكاشف، الخطوة 4) حسب الرغبة؛ تتكون الضوابط السلبية عادةً من الراشح الخلوي لمزرعة الورم النخاعي الأصلي (انظر الشكل 1 للتصميم المقترح). 14. للتحضير للخطوة 15، اغسل 3 مرات، ورجّ المحتويات المتبقية، وجففها. حضانة مُقترن الإنزيم: 15. ضع 100 ميكرولتر من محلول الجسم المضاد أحادي النسيلة للفأر المُوسوم بإنزيم بيروكسيداز الفجل (HRP) والمُضاد للغلوبولين المناعي للفئران (انظر تحضير الكاشف، الخطوة 5) في كل بئر، وحضّنها في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. 16. للتحضير للخطوة 17، اغسل 6 مرات، مع نقع الآبار لمدة 30 ثانية إلى دقيقة واحدة في كل غسلة. يُعد الغسل الجيد في هذه الخطوة بالغ الأهمية. إظهار اللون: 17. أضف 100 ميكرولتر من محلول الركيزة المُحضر (انظر تحضير الكاشف، الخطوة 6) إلى كل بئر، وحضّن الصفيحة لمدة 3 إلى 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. ستظهر الآبار ذات التفاعل الإيجابي لونًا أزرق مخضرًا. أما الآبار ذات التفاعل السلبي فستكون عديمة اللون. ١٨. ضع ٥٠ ميكرولتر من محلول الإيقاف في كل بئر باستخدام ماصة. ستصبح الآبار ذات التفاعل الإيجابي صفراء. قراءة نتيجة اللوحة: ١٩. اقرأ بصريًا أو باستخدام مطياف ضوئي عند ٤٥٠ نانومتر. إذا كان تصحيح الطول الموجي متاحًا، اطرح الامتصاص عند ٥٧٠ نانومتر من الامتصاص عند ٤٥٠ نانومتر. يوضح الشكل ٢ مثالًا على القراءة البصرية للغلوبولينات المناعية من مختلف الأنواع. خطر: يحتوي كاشف الركيزة B (المكون ٥١-٠٤١٤١E) على ٣٣.٠٥٪ ميثانول (وزن/وزن). بيانات المخاطر: سائل وبخار قابل للاشتعال. سام عند البلع أو ملامسة الجلد أو الاستنشاق. يسبب تلفًا للجهاز العصبي المركزي. طريقة التعرض: عن طريق الفم. بيانات الاحتياطات: يُحفظ بعيدًا عن الحرارة/الشرر/اللهب المكشوف/الأسطح الساخنة. ممنوع التدخين. في حالة نشوب حريق: استخدم وسائل إطفاء مناسبة لإطفاء الحريق. ارتدِ قفازات واقية/نظارات واقية. ارتدِ ملابس واقية. لا تستنشق الرذاذ/الأبخرة/البخاخ. في حالة ملامسة الجلد (أو الشعر): انزع/اخلع جميع الملابس الملوثة فورًا. اغسل الجلد بالماء/استحم. في حالة الاستنشاق: انقل المصاب إلى الهواء الطلق وأبقِه في وضع مريح للتنفس. في حالة التعرض أو القلق: اتصل بمركز السموم/الطبيب. يُحفظ في مكان جيد التهوية. أبقِ العبوة مغلقة بإحكام. خطر: يحتوي محلول الإيقاف (المكون 51-04161E) على 15.23% من حمض الفوسفوريك (وزن/وزن). بيانات المخاطر: يسبب حروقًا جلدية شديدة وتلفًا في العين. بيانات الاحتياطات: ارتدِ قفازات واقية/نظارات واقية. ارتدِ ملابس واقية. في حالة ملامسة الجلد (أو الشعر): انزع/اخلع جميع الملابس الملوثة فورًا. اغسل الجلد بالماء/استحم. في حالة ملامسة العينين: اشطفهما بحذر بالماء لعدة دقائق. أزل العدسات اللاصقة، إن وجدت وكان من السهل إزالتها. استمر في الشطف. في حالة الاستنشاق: انقل المصاب إلى الهواء الطلق وأبقِه في وضع مريح للتنفس. تخلص من المحتويات/العبوة وفقًا للوائح المحلية/الإقليمية/الوطنية/الدولية. تحذير: يحتوي HRP Mouse Anti-Rat Ig (100x) (المكون 51-04127E) على 0.004% (وزن/وزن)، ويحتوي محلول BSA بنسبة 10% (المكون 51-04181E) على 0.003% (وزن/وزن) من خليط CMIT/MIT (3:1)، وهو خليط من: 5-كلورو-2-ميثيل-4-أيزوثيازولين-3-ون [رقم EC 247-500-7] و2-ميثيل-4-أيزوثيازولين-3-ون [رقم EC 220-239-6] (3:1). بيانات المخاطر: قد يسبب رد فعل تحسسي جلدي. إرشادات السلامة: ارتدِ قفازات واقية/نظارات واقية. ارتدِ ملابس واقية. تجنب استنشاق الرذاذ/الأبخرة. في حال حدوث تهيج أو طفح جلدي: استشر طبيباً. في حال ملامسة الجلد: اغسل جيداً بالماء. تخلص من المحتويات/العبوة وفقاً للوائح المحلية/الإقليمية/الوطنية/الدولية.
إشعارات المنتج: مصدر جميع بروتينات المصل هو مسالخ معتمدة من وزارة الزراعة الأمريكية، وتقع في الولايات المتحدة. تحذير: ينتج أزيد الصوديوم حمض الهيدرازويك شديد السمية في الظروف الحمضية. خفف مركبات الأزيد بالماء الجاري قبل التخلص منها لتجنب تراكم رواسب قابلة للانفجار في أنابيب الصرف الصحي. يرجى مراجعة www.bdbiosciences.com/us/s/resources للاطلاع على البروتوكولات الفنية.